Pesquisa
Ação da ciclodextrina associada ao colesterol frente a viabilidade do sêmen ovino.
Mestrado em Ciência Animal com Ênfase em Produtos Bioativos
Autor: Juliano Pianowski Marques da Silva
Orientador: Rosiara Rosaria Dias Maziero
Defendido em: 31/07/2018
Resumo
A biotecnologia do sêmen proporciona inúmeras vantagens para os programas de reprodução assistida. Em ovinos, poucos estudos avaliaram as metodologias de criopreservação do sêmen, impedindo a plena difusão desta biotecnologia, visto que este processo pode acarretar danos irreversíveis a célula espermática. A incorporação de ciclodextrina ligada ao colesterol (CLC) representa uma estratégia para aumentar a resistência dos espermatozoides a baixas temperaturas. Entretanto, níveis elevados de colesterol na membrana celular podem interferir na capacitação espermática. Assim, o objetivo deste estudo foi determinar a concentração ideal de CLC em diluidor comercial para a melhora dos parâmetros de cinética espermática e viabilidade celular, em ejaculados ovinos. Para tanto, foram utilizados 5 ovinos de diferentes raças, com idade entre 12 e 30 meses e escore corporal 3 (1-5). Foram utilizados cinco ejaculados de cada animal, colhidos com intervalos de uma semana, utilizando-se do método da eletroejaculação. Após a colheita as amostras seminas eram imediatamente avaliadas quanto a motilidade espermática (0% a 100%), vigor espermático (1-5) e concentração. Foram selecionados ejaculados com motilidade espermática ≥ 80% e concentração ≥ 1 bilhões/mL. Os ejaculados foram divididos em 3 grupos de estudos: grupo controle (C): ejaculado diluído em meio comercial, grupo 1 ejaculado diluído em meio comercial acrescido com 1 mg de Metil-β-ciclodextrina ligada ao colesterol, grupo 2 ejaculado diluído em meio comercial com 2 mg de Metil-β-ciclodextrina ligada ao colesterol. As amostras com 120 x 106 espermatozoides totais permaneceram incubadas por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, foram diluídas em meio comercial, com concentração de 100 milhões/mL e posteriormente acondicionadas em palhetas de 0,5 mL. As amostras foram mantidas por 4 horas a 5ºC e posteriormente, mantidas por 10 minutos em vapor de nitrogênio líquido (N2L) em caixa isotérmica e em seguida, mergulhadas em N2L e armazenadas em botijão criogênico. Para as análises pós-descongelação, as palhetas foram descongeladas a 46ºC por 20 segundos. Foram avaliados os parâmetros de cinética espermática pelo sistema computadorizado (CASA - Computer-Assisted Semen Analisys) e viabilidade celular (integridade da membrana plasmática e acrossomal e ânion superóxido) por citometria de fluxo. Pôde-se constatar que, a utilização de CLC na concentração de 1 mg se mostrou eficaz para a melhora dos parâmetros de motilidade progressiva (MT, %), porcentagem de espermatozoides rápidos (RAP, %) e integridade de membrana plasmática. Além disto, o grupo de estudo com 1 mg de CLC diminuiu o nível de formação de ânion superóxido, radical livre prejudicial ao espermatozoide. A utilização de 2 mg de CLC não trouxe benefício nos parâmetros avaliados, com diminuição da velocidade de deslocamento dos espermatozoides (p < 0,05).
Palavras-chave
Criopreservação. Parâmetros espermáticos. Reprodução. Ovino.
Title
action of cholesterol-associated cyclodextrin versus viability of ovine semen.
Abstract
Semen biotechnology offers a number of advantages for assisted reproduction programs. In sheep, few studies have evaluated the methodologies of cryopreservation of consumption, preventing the full diffusion of biotechnology, and this process can lead to irreversible damage to a sperm cell. The incorporation of cholesterol-linked cyclodextraction (CLC) represents a strategy to increase the resistance of spermatozoa at low temperatures. However, elevated levels of cell membrane may interfere with sperm capacity. Thus, the objective of this study was to determine the concentration of CLC in a commercial system to obtain the parameters of sperm kinetics and via cell, in ovine ejaculates. For that, 5 sheep of different races were used, with age between 12 and 30 months and body score 3 (1-5). Five ejaculates were obtained from each animal at one week intervals, using the electroejaculation method and blank, with a spermatic (0% to 100%), spermatic (1-5) and concentration evaluation. We found ejaculates with sperm motility ≥ 80% and concentration ≥ 1 billion / mL. The ejaculates were divided into 3 groups of studies: control group (C): ejaculate diluted commercially, group 1 ejaculated diluted commercially with 1 mg of cholesterol-bound methyl b-cyclodextrin, ejaculated group 2 diluted commercially with 2 mg of cholesterol-bound methylcyclodextrin. As samples with 120 x 106 spermatozoa, the amounts remain incubated for 10 minutes at room temperature. Afterwards, they were diluted again in commercial medium, with concentration of 100 million / mL and later conditioned in 0.5 mL vats. As the samples were held for 4 hours at 5 ° C and then held for 10 minutes in liquid vapor (N2L) in isothermal box and then, they were eliminated in N2L and stored in cryogenic cylinder. For the post-thawing descriptions, the vanes were thawed at 46 ° C for 20 seconds. The parameters of sperm kinetics by the computerized system (computer assisted analysis) and cell viability (flow cytometry) were analyzed. That could be seen, the use of CLC at a concentration of 1 mg was effective for improvement of motility parameters (TM,%), percentage of rapid sperm (RAP%) and plasma and acrosomal membrane. In addition, the study group with 1 mg CLC decreased the level of superoxide anion formation, a free radical detrimental to sperm. The use of 2 mg of CLC was not smarter for the parameters evaluated, with sperm displacement velocity (p <0.05).
Keywords
Cryopreservation. Sperm parameters. Reproduction. Ovine.