Pesquisa
Análise molecular de Toxoplasma gondii em tecidos de Gallus gallus utilizando a PCR em tempo real
Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Cleiton Paulo Aigner
Orientador: Aristeu Vieira da Silva
Defendido em: 21/08/2008
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Resumo
Toxoplasma gondii é um protozoário parasito intracelular obrigatório, de distribuição mundial, que acomete todas as espécies homeotérmicas, incluindo o ser humano e animais de companhia e produção. As galinhas criadas extensivamente têm sido estudadas em todo o mundo como marcadoras da contaminação ambiental e no estudo da variabilidade genética do parasito. A PCR em tempo real é uma metodologia onde os processos de amplificação e detecção são produzidos de maneira simultânea, usando marcadores fluorescentes. A detecção da fluorescência permite medir durante a amplificação a quantidade de DNA sintetizado, já que a fluorescência emitida é proporcional à quantidade de DNA formado, o que permite conhecer e registrar durante as fases a cinética da reação de amplificação. Diversos artigos descrevem ensaios moleculares para detecção de toxoplasmose, mas a maior parte destes está direcionada ao diagnóstico humano ou estudos filogenéticos. Este trabalho objetivou quantificar o parasito em amostras de cérebro e coração de galinhas sorologicamente positivas ao parasito, pela PCR em tempo real para um gene repetitivo. Amostras de sangue de 65 galinhas foram avaliadas para a presença de anticorpos pelo método de aglutinação direta (MAD), encontrando-se 28 amostras positivas. De 26 destas galinhas foram coletados cérebro e coração, submetidos à digestão pela pepsina e extração de DNA pelo Trizol®. O DNA parasitário foi amplificado e detectado em equipamento StepOneTM Real Time PCR System pelo sistema SYBR® Green. A quantificação do DNA se deu pela comparação entre os sinais de amplificação das amostras com aqueles obtidos em suspensões de amostras de cérebro e coração artificialmente contaminadas com 104 a 100 taquizoítos da cepa RH. DNA parasitário foi detectado em 24 das 26 amostras examinadas, sem diferença significativa entre os tecidos examinados, seja na freqüência de positividade, seja na quantidade de parasitos por grama de tecido. Correlação positiva entre os títulos de anticorpos e a quantificação de parasitos foi registrada para as amostras de cérebro, mas não para as amostras de coração.
Palavras-chave
Toxoplasma gondii; PCR em tempo real; galinha; diagnóstico; quantificação
Title
Toxoplasma gondii QUANTIFICATION IN TISSUE OF Gallus gallus USING REAL TIME PCR
Abstract
Toxoplasma gondii is a worldwide distributed obligatory intracellular parasite that affects all homoeothermic species, including humans, pets and livestock. Chicken bred in free-range conditions have been studied all over the world as markers of environmental contamination and in the study of the genetic variability of the parasite. Real time PCR is a methodology where amplification and detection were produced at same time, using fluorescent markers. Fluorescence detection permits the measure of synthesized DNA amount during amplification phase, because the fluorescence signal is proportional to the amount of synthesized DNA, and this leads to know and register during this process the amplification reaction kinetics. Many papers describe molecular assays for toxoplasmosis detection, mainly directed for diagnosis in humans or phylogenetics studies. The objective of this study was the quantification of the parasite in brain and heart samples of chickens serologically positive for T. gondii using real-time PCR based on a repetitive element. Blood samples of 65 chickens were analyzed for the presence of antibodies using the modified agglutination test (MAT), producing 28 positive samples. Brain and heart samples were collected from 26 MAT positive chickens, and these samples were digested by acid pepsin and submitted to DNA extraction using Trizol®. Parasite DNA was amplified and detected in a StepOne® Real Time PCR System with fluorescent detection using SYBR® Green. DNA quantification was obtained by means of signal amplification observed in the samples compared with suspensions of brain and heart artificially contaminated with 104 to 100 RH strain tachyzoites. The DNA of the parasite was detected in 24 of the 26 samples analyzed, with no statistical difference between the different tissues, either in the frequency of positive results or in the quantity of parasites per gram of tissue. A positive correlation between antibody titers and parasite quantification was observed in brain, but not in heart samples.
Keywords
Toxoplasma gondii; Chicken; Real-time PCR; Diagnosis; Quantification