Pesquisa
Análise morfométrica da parede e dinâmica do epitélio do Jejuno de suínos com toxoplasmose
Mestrado em Ciência Animal com Ênfase em Produtos Bioativos
Autor: Patrícia de Cássia da Silva
Orientador: Eduardo José de Almeida Araújo
Defendido em: 08/07/2009
Resumo
Objetivou-se avaliar morfometricamente a parede intestinal, bem como a dinâmica das células presentes no epitélio de revestimento do jejuno de suínos infectados por uma cepa genótipo tipo III de Toxoplasma gondii. Para tanto, utilizaram-se dez suínos da mesma ninhada resultantes do cruzamento das raças Pietrain e Wessex com oitenta e oito dias de idade mantidos em baias coletivas, sendo estas higienizadas diariamente para evitar acesso de roedores. Todos os animais receberam ração comercial balanceada e água ad libitum. Os animais foram distribuídos equitativamente em dois grupos, de forma que não apresentassem diferença significativa quanto ao peso corporal. O primeiro grupo (denominado controle, GC, n = 5) recebeu por via oral 30 ml de solução salina fosfatada (pH 7,4) sem o inóculo e o segundo grupo (denominado experimental, GE, n = 5) foi inoculado com 30 ml de solução salina fosfatada (pH 7,4) contendo aproximadamente 5.000 oocistos da cepa M7741 de T gondii. Trinta dias após a inoculação (DPI), todos os animais foram anestesiados e submetidos a uma biópsia intestinal por enterectomia de 10 cm do jejuno. Sessenta DPI os animais foram novamente para cirurgia seguindo mesmo protocolo de 30 DPI, no intuito de colher mais um fragmento jejunal, sendo que neste momento, ambos os grupos foram submetidos à eutanásia após procedimento cirúrgico. Os fragmentos coletados foram fixados em líquido de Bouin, desidratados em série ascendente de álcool etílico, diafanizados em xilol e incluídos em parafina. Cortes transversais de 4 ųm foram corados com Hematoxilina-Eosina (HE), Periodic Acid Schiff (PAS) para detecção de mucinas neutras e sialomucinas lábeis, Alcian Blue (AB) pH 2,5 para detecção de sialomucinas e sulfomucinas, Alcian Blue (AB) pH1,0 para detecção de sulfomucinas. Para confirmar a infecção pelo T. gondii, realizou-se sorologia, investigação de fragmentos do DNA do parasito em amostras do intestino e reisolamento do parasito em camundongos. Para sorologia, amostras de sangue foram coletadas de todos os animais em 30 e 60 DPI, as quais foram submetidas à técnica de aglutinação direta para detecção de IgG anti-T.gondii. Para investigação de fragmentos do DNA do parasito, parte dos segmentos intestinais colhidos em ambas as cirurgias foram lavados com PBS, dissecados e submetidos à técnica de reação da polimerase (PCR). Por fim, para o reisolamento do parasito, colheram-se tecidos de vários órgãos dos suínos do grupo experimental (durante a cirurgia 60 DPI), os quais foram digeridos em pepsina e inoculados em camundongos, sendo que os que apresentaram sorologia positiva ao T. gondii demonstraram reisolamento do parasito. Para análise morfométrica foram utilizados cortes transversais do jejuno corados com HE, os quais foram divididos em oito partes onde foram feitas dez medidas, portanto 80 medidas por animal. Com as imagens ampliadas pela objetiva de 4X foram realizadas medidas da espessura da parede total, imagens ampliadas com a objetiva de 10X foram utilizadas para medir a altura dos vilos e a túnica mucosa, já com as imagens ampliadas com a objetiva de 20X mediu-se a espessura da túnica muscular e finalmente, com a objetiva de 100X mediu-se altura dos enterócitos e o maior diâmetro do núcleo dos enterócitos. Todas essas medidas foram realizadas com o software Motic Images Plus 2.0. Também foi avaliada a proporção de linfócitos intraepiteliais e enterócitos presentes no epitélio de cada suíno. Além disso, foi avaliada a secreção de mucinas por intermédio de cortes corados com PAS, Alcian Blue pH 2,5 e Alcian Blue pH 1,0. Para tanto, cortes da circunferência intestinal também foram divididos em oito partes iguais, e com a objetiva de 40X contou-se o número total de células caliciformes e mediu-se a área total de mucosa onde se encontravam tais tipos celulares. Todos os dados foram submetidos ao teste D`Agostinho Pearson para verificação do tipo de distribuição. Dados com distribuição normal foram expressos como média desvio-padrão, e os de distribuição livre foram expressos como mediana e percentis 25 e 75 (P25; P75). Para comparar os grupos controle e experimental, utilizou-se teste t para dados que tinham distribuição normal e Mann-Whitney para os de distribuição livre. De acordo com o exame sorológico, todos os animais do GE tiveram resultado positivo para presença de anti-T. gondii, enquanto os do GC tiveram resultado negativo. No entanto a análise por PCR demonstrou a presença do parasito em um animal do grupo experimental, especificamente no estrato mucosa + submucosa. Todos os animais do GE começaram a apresentar fezes menos sólidas logo após a inoculação e diarréia a partir do 13˚ DPI. Quanto à análise morfométrica do jejuno, observou-se que aos 30 DPI houve aumento de 4,2% na espessura da parede total e 9,7% na altura dos vilos e diminuição de 23,9% da túnica muscular. Já aos 60 DPI, as alterações foram mais intensas e provocaram um aumento da parede total de 25,1%; da túnica muscular de 18,6%; da túnica mucosa de 32,0%; da altura dos vilos de 12,8% e de 8,6% na altura dos enterócitos. Quanto ao número de linfócitos intraepiteliais observou-se decréscimo da densidade populacional dessas células nos animais do GE aos 60 DPI. A secreção de mucinas não sofreu alteração.
Palavras-chave
Toxoplasmose; Sus scrofa; intestino delgado; histologia; glicoconjugados.
Title
Morphometric analysis of the jejunal wall and dynamic of its epithelium in swines with toxoplasmosis
Abstract
This study aimed at assessing the changes caused by the infection with Toxoplasma gondii in swine jejunum. Ten 88-day-old crossbred swines (Pietran and Wessex) were maintained in feedlots in the Veterinary Hospital of Universidade Paranaense – UNIPAR (Umuarama, Paraná, Brazil). All animals were fed a balanced diet and water ad libitum and were assigned assigned into two groups: Control Group (CG = 5) and Experimental Group (EG = 5). Animals from the EG orally received 5,000 oocysts from the genotype III Toxoplasma gondii M7741 strain. All animals were submitted to transabdominal biopsy 30 and 60 days post-inoculation (DPI). At the moment of the surgery, each animal was anesthesized for the removal of approximately 10 cm of the jejunal segment which were fixed in Bouin solution, dehydrated in ascending series of alcohol, diaphanized in xylol and paraffin-embedded. Tranversal cuts (4m) were stained with Hematoxilin-Eosin (HE), Periodic Acid Schiff (PAS) to detect neutral mucins, Alcian Blue (AB) pH 2.5 to detect sialomucins and sulphomucins and Alcian Blue (AB) pH 1.0 to detect sulphomucins. To confirm the infection with T. gondii, it was realized serology, investigation of T. gondii DNA fragments in intestinal samples and reisolation of the parasite in mice. For the serology, blood was collected from all animals at 30 and 60 DPI and was analyzed for the detection of anti-T. gondii IgG presence through direct agglutination test. For the investigation of T. gondii DNA fragments, part of the jejunum collected in both surgeries was washed in PBS, dissected and submitted to polymerase chain reaction (PCR). For the reisolation of the parasite, tissue from different organs was digested in acid solution with pepsin and inoculated in mice, from which who presented positive serology to T. gondii showed reisolation of the parasite. For the morphometric analysis, it were used histological cuts stained with HE which were divided into eight part where were realized the measurements totalizing eighty measurements by animal. Images magnified with 4x objective lense were used to measure the total wall thickness, images magnified with 10x objective lense were used to measure the villus heigth and mucosa thickness, images magnified with 20x objective lense were used to measure external muscle thickness and, finally, images magnified with 100x objective lense were used to measure the enterocyte heigth and their bigger diameter nuclei. All measurements were carried out with Motic Images Plus 2.0. It was also evaluated the ratio between intraepithelial lymphocytes and enterocytes presents in the epithelium from each swine. Besides, it was evaluated the secretion of mucins using histological cuts stained with PAS, AB pH 2.5 e AB pH 1.0. For that, the globet cells in 0.3 mm2 of the mucosa of each animal were quantified. The account was carried out from images captured using a 40x objective lense. Data were submitted to D’Agostino test in order to verify the type of distribution – mean ± standard deviation was used for normal distributional data and the others were expressed in median and percentiles 25 and 75 (P25 e P75). In order to compare data between CG and EG, Student’s t-test was used for normal distributional data and Mann-Whitney test for free distribution data. According to the serologic exam, all animals from the EG presented positive result for the presence of anti-T. gondii whereas the CG animals presented negative result. Besides, the presence of the parasite in one animal from the EG, specifically in the extract from mucosa + submucosa, was noticed in the PCR analysis. With respect to results of the experiment: all animals from the EG presented recurring diarrhea 13 days after inoculation – fact not noticed in any animal from the CG. Considering the morphometric analysis of the jejunum, it was observed – 30 DPI – increase in 4.2% of the total wall thickness, 9.7% of the villus height and decrease in 23.9% of the external muscle thickness. For another hand – 60 DPI – the alterations were more intense and provoke increase of total wall thickness in 25.1%; of external muscle in 18.6%; of the mucosa in 32.0%; the villus height in 12.8% and the enterocyte height in 8.6%. Besides, it was noticed that the number of intraepithelial lymphocytes decrease in the swines from EG at 60 DPI. However, the secretion of mucins did not change.
Keywords
Toxoplasmosis; Sus scrofa; small intestine; histology; glicoconjugated.