Pesquisa
Análise quantitativa e morfométrica de neurônios do plexo mientérico do íleo e cólon descendente de ratos infectados por Toxoplasma gondii
Mestrado em Ciência Animal com Ênfase em Produtos Bioativos
Autor: Elaine Yae Yamashita Sugauara
Orientador: Eduardo José de Almeida Araújo
Defendido em: 27/02/2008
Artigo na Íntegra:
http://www.scielo.br/pdf/anp/v66n3a/a15v66n3a.pdfhttp://www.periodicos.uem.br/ojs/index.php/ActaSciBiolSci/article/view/796/796
Resumo
Objetivou-se avaliar as alterações causadas por duas cepas de Toxoplasma gondii, uma do tipo II e outra do tipo III, sobre os neurônios do plexo mientérico do íleo terminal e do cólon descendente de ratos através de quantificação e morfometria. Para tanto, utilizou-se vinte e seis ratos (Rattus norvegicus) Wistar machos com sessenta dias de idade mantidos em caixas com grades individuais num biotério com temperatura constante de 25º C e alternância de ciclos claro-escuro de 12 horas. Todos os animais receberam ração comercial para roedores (NUVITAL®) e água ad libitum. Os animais foram divididos em seis grupos. Quatro grupos participaram do experimento com infecção aguda e crônica causada por uma cepa genótipo III (Experimento A): grupo controle agudo (GCA, n = 4), grupo experimental agudo (GEA, n = 4), grupo controle crônico (GCC, n = 5) e grupo experimental crônico (GEC, n = 5). Os animais do GEA e GEC receberam 104 taquizoítos por via oral. Dois grupos participaram do experimento com infecção aguda causada por uma cepa genótipo II (Experimento B): grupo controle (GC, n = 4) e grupo experimental (GE, n = 4), sendo este inoculado por via oral com 20 cistos teciduais da cepa ME-49. Os animais pertencentes aos grupos GCA e GEA do Experimento A, assim como todos os grupos do experimento B, foram submetidos à eutanásia 24 horas após a infecção (fase aguda), e os grupos GCC e GEC do Experimento A 30 dias após a infecção (fase crônica). No momento da eutanásia, cada animal foi anestesiado visando laparotomia para retirada do íleo terminal e do cólon descendente, e colheita de sangue através de punção através do plexo retro-orbital, no caso dos animais do GCC e GEC. Através do método de aglutinação direta, o sangue coletado foi processado para detecção da presença de anticorpos anti-T. gondi. Após retirada, os segmentos intestinais descritos acima foram lavados e fixados utilizando formol acético. Em seguida, foram dissecados, com retirada da túnica mucosa e tela submucosa, restando preparados totais formados pela túnica muscular e serosa, os quais foram corados pela técnica de Giemsa. De cada animal foi contado o número total de neurônios mientéricos em 120 campos microscópicos (ampliados 400 vezes) distribuídos uniformemente por toda a circunferência intestinal. Além disso, foi mensurado a área do pericário, do núcleo e citoplasma de 300 neurônios do plexo mientérico de cada animal. Os dados foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov para verificar o tipo de distribuição, sendo expressos como média ± desvios-padrão, os dados de distribuição normal e os demais como mediana e percentis 25 e 75 (P25 e P75). Para comparar os dados entre os grupos controle e experimental, utilizou-se o teste t de Student para dados com distribuição normal e o teste de Mann-Whitney para os de distribuição livre. De acordo com o exame sorológico, todos os animais do GEC tiveram resultado positivo para presença de anti-T. gondii, enquanto os do GCC tiveram resultado negativo. Quanto aos resultados, para o experimento A: não foram observadas alterações nas dimensões dos segmentos intestinais coletados, exceto redução no comprimento, largura e área do jejuno-íleo dos animais do grupo GEC (p<0,05). Não foi observada perda neuronal. Durante a infecção aguda, observou-se atrofia nos neurônios mientéricos do cólon descendente de aproximadamente 8 %. Já na infecção crônica (30 dias), constatou-se uma intensa atrofia nos neurônios mientéricos do íleo terminal (~52%) e hipertrofia nos do cólon descendente (~31%). O resultado da análise de correlação entre as áreas mensuradas dos neurônios mientéricos demonstrou que tanto na fase aguda como na crônica, apenas o grau de correlação entre a área do pericário e do citoplasma se manteve constante (p<0,05). Quanto à freqüência de neurônios divididos em classes de acordo com a área do pericário, observa-se que a maior parte se concentra num espectro de até 200 m2, tanto no íleo terminal como no cólon descendente. A infecção crônica provocou no íleo terminal um aumento do número de neurônios menores que 50 m2, enquanto que no cólon descendente houve uma redução do número de neurônios menores que 100 m2 e um aumento do número de neurônios entre 151 e 250 m2. Quanto aos resultados do experimento B, observou-se que não houve alteração nas dimensões dos órgãos coletados, bem como perda neuronal. Os neurônios do íleo terminal tornaram-se hipertróficos (~30%), já os do cólon descendente não apresentaram alteração morfométrica. Quanto à freqüência de neurônios divididos em classes de acordo com a área do pericário, observa-se que a maior parte se concentra em até 200 m2, e que a infecção causou redução do número de neurônios do cólon descendente pertencentes à classe de 101 a 200 m2. Já comparando o número de neurônios divididos em classes de acordo com a razão entre a área do núcleo e a área do pericário, observou-se que no íleo terminal há um predomínio de neurônios em que o núcleo ocupa 41 a 60 % do pericário em ambos os grupos e já no cólon descendente a maior parte dos neurônios tem núcleos que ocupam menos de 40% do pericário. Nesta distribuição de freqüência, verificou-se que a infecção causou redução do número de neurônios do íleo terminal com núcleos ocupando entre 41 a 50% do pericário. Conclui-se que ambos os genótipos de T. gondii utilizados neste estudo não causaram morte neuronal, contudo observou-se que a cepa de genótipo II causou hipertrofia dos neurônios mientéricos do íleo terminal durante a infecção aguda. A cepa genótipo III não causou alterações morfométricas nos neurônios do íleo terminal durante a infecção aguda, contudo induziu atrofia durante a fase crônica. Para o cólon descendente, esta cepa causou atrofia na fase aguda e hipertrofia na fase crônica.
Palavras-chave
Toxoplasmose; Sistema Nervoso Entérico; Morfologia
Title
Morphometric and quantitative analyses of neurons of the myenteric plexus in the ileum and descending colon of rats infected by Toxoplasma gondii
Abstract
Alterations caused by two Toxoplasma gondii strains – type II and III – on the neurons of the myenteric plexus in the terminal ileum and descending colon of rats through quantification and morphometrics were assessed. Therefore, 26 male 60-day-old Wistar rats were kept in boxes with individual grids in a bioterium constantly at 25°C with 12-hr light/12-hr dark alternate cycles. All animals received rat chow-fed (NUVITAL®) and water ad libitum. They were divided into six groups. Four groups with acute or chronic infection caused by the genotype III strain (Experiment A) took part in the experiment: Acute Control Group (ACG, n = 4); Acute Experimental Group (AEG, n = 4); Chronic Control Group (CCG, n = 5), and the Chronic Experimental Group (CEG, n = 5). The animals from the ACG and ECG received 104 tachyzoites orally. Two groups with acute infection caused by a genotype II strain (Experiment B) took part in the experiment: Control Group (CG, n = 4) and Experimental Group (EG, n = 4), which was orally inoculated with 20 tissue cysts from the ME-49 strain. Animals belonging to the ACG and GEA from Experiment A, as well as all the groups from Experiment B, were submitted to euthanasia 24 hour after the infection (acute phase), and the CCG and ECG from Experiment A 30 days after the infection (chronic phase). At the moment of euthanasia, each animal was anesthetized for laparotomy in order to remove the terminal ileum and descending colon, as well as collecting blood by puncture through the retro-orbital plexus for the animals from the CCG and ECG. The collected blood was processed for the detection of the presence of anti-T. gondii antibodies by the direct agglutination method. After the removal, the intestinal segments described above were washed and fixed by using acetic formol. Then, they were dissected; the mucosa and submucosa were removed, leaving the whole mounted formed by the muscle and serous which were stained with Giemsa. The total number of myenteric neurons of each animal was cut into 120 microscopic fields (extended 400 times) was counted and distributed uniformly all around the intestinal circumference. Besides, the nucleus, cytoplasm and soma areas from 300 neurons in the myenteric plexus of each animal were measured. Data were submitted to the Kolmogorov-Smirnov test in order to verify the distribution type being expressed as mean ± standard deviation, and the normal distribution data and others were expressed as median and percentiles 25 and 75 (P25 and P75). In order to compare data among the control and experimental groups, the Student-t test was used for normal distribution data, and the Mann-Whitney test for the free distribution data. According to the serologic, all the animals from the ECG presented positive results regarding the presence of anti-T.gondii, whereas the CCG presented negative results. With respect to the results for Experiment A: alterations on the dimensions of the collected intestinal segments were not observed, except the reduction of the length, width, and area of the ileum-jejunum from the animals from ECG (p<0.05). Neuronal losses were not observed. Atrophy of the myenteric neurons in the descending colon of approximately 8% were observed during acute infection. For chronic infection (30 days), intense atrophy of the myenteric neurons in the terminal ileum (~52%) and hypertrophy in the descending colon (~31%) was observed. Results from the analysis of the correlation among the measured areas and the myenteric neurons demonstrated that in the acute phase, only the degree of correlation between the soma area and the cytoplasm were constant (p<0.05). Concerning the frequency of the neurons divided into classes according to the soma area, it was observed that the most of them concentrate within an area not larger than 200 µm2 – either in the terminal ileum or the descending colon. Chronic infection provoked an increase in the number of neurons smaller than 50 µm2 in the terminal ileum, whereas there was a reduction of the number of neurons smaller than 100 µm2 in the descending colon and an increase of the number of neurons from 151 µm2 through 250 µm2. For the results for Experiment B, alterations on the dimensions of the collected organs and neuronal loss were not observed. The neurons in the terminal ileum became hypertrophic (~30%), as the ones from the descending colon did not present any morphometric alterations. With respect to the frequency of neurons divided into classes according to the soma area, it was observed that most of them are concentrated in up to 200 µm2, and that the infection caused the reduction of the number of neurons in the descending colons belonging to the class from 101 µm2 through 200µm2. While comparing the number of neurons divided into classes according to the soma-nucleus area ratio, it was observed that, in the terminal ileum, there is a prevalence of neurons in which the nucleus occupies 41 through 60% of the soma in both groups, whereas in the descending colon, most of the neurons present nuclei occupying less than 40% of the soma. In this frequency distribution, it was verified that the infection caused reduction of the number of neurons in the terminal ileum with nuclei occupying from 41 through 50% of the soma. It is concluded that both T. gondii genotypes used in this study did not cause any neuronal losses; however, it was observed that the genotype II strain caused hypertrophy of the myenteric neurons in the terminal ileum during the acute infection. The genotype III did not cause any morphometric alterations in the neurons in the terminal ileum during acute infection; however, it induced to atrophy the chronic phase. For the descending colon, this strain caused atrophy during the acute phase and hypertrophy during the chronic phase.
Keywords
Toxoplasmosis, Enteric Nervous System, Morphology