Pesquisa
Atividades biológicas do extrato bruto, óleo essencial e frações obtidas das folhas de Eugenia pyriformis Cambess (Myrtaceae)
Doutorado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Jaqueline Pavelegini de Medeiros
Orientador: Zilda Cristiani Gazim
Defendido em: 28/02/2020
Resumo
O objetivo deste estudo foi investigar os constituintes químicos do extrato bruto e do óleo essencial (OE) e frações obtidas das folhas de Eugenia pyriformis e mensurar as atividades antioxidantes, antimicrobiana, anti-inflamatória, antitumoral e citotóxica. O presenta trabalho está organizado em quatro capítulos. No Capítulo 1 foi avaliado o potencial antioxidante do extrato bruto (EBEp) e frações das folhas Eugenia pyriformis Cambess obtidas por fracionamento cromatográfico com hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol obtendo 14 frações que foram avaliadas quanto ao potencial antioxidante e destas, 5 se destacaram. O EBEp e as frações foram identificados por cromatografia líquida de alta eficiência à espectrometria de massas de alta resolução (CLAE-ESI/qTOF). As atividades antioxidantes do EBEp e das frações foram investigadas pelos métodos de captura do radical livre (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) (DPPH), pelo método de redução do ferro (FRAP), pelo sistema da co-oxidação do β-caroteno/ácido linoleico e pela determinação dos fenóis totais (FT). Foram identificados os compostos Ácido gálico (no EBEp e FR1 e FR4) , Ácido p-cumárico (no EBEp e FR5), Ácido ferúlico (no EBEp), Miricetina ( no EBEp e FR2), Quercetina ( no EBEp , FR1 e FR2, FR3 e FR4) e Caempferol (no EBEp e FR2) e o Ácido p-cumárico (no EBEp e FR5). Pelo método do DPPH, o EBEp e FR4 apresentaram maior capacidade de neutralização do radical livre DPPH com EC50 de 0,144 e 0,187 mg/mL, respectivamente; pelo método do FRAP, a FR1 mostrou maior potencial na redução do íon Fe(II) (8,202 µM sulfato ferroso/mg amostra) quando comparado às demais frações e EBEp. Os resultados da determinação dos fenóis totais mostraram que as FR1 e FR3 apresentaram maior conteúdo de fenóis totais (298,810 e 308,929 µg de ácido gálico/mg de amostra, respectivamente). O óleo essencial (OE) das folhas de E. pyriformis foi obtido por hidrodestilação (3h) e caracterizado por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM), e no Capítulo 2 foi avaliado a atividade antimicrobiana do OE frente às bactérias as Gram-positivas Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Micrococcus flavus, e Staphylococcus. aureus, e Gram-negativas Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, e Salmonella typhimurim e fungos Aspergillus fumigatus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Aspergillus versicolor, Penicillium funiculosum, Penicillium ochrochloron, Penicillium verrucosum e Trichoderma viride. O método utilizado foi o de microdiluição em caldo determinando a Concentração Inibitória Mínima (CIM), bacteriostática mínima (CBM) e fungistática mínima (CFM). A identificação química permitiu a caracterização de 24 compostos. A classe majoritária foi dos sesquiterpenos oxigenados (84,1%), seguido dos sesquiterpenos hidrocarbonetos (14,7%). Os compostos majoritários foram espatulenol (45,6%) e óxido de cariofileno (12,7%). O OE das folhas de E. pyriformis apresentou atividade fungistática e fungicida contra os fungos P. ochrochloron com (CIM 1,87 mg/mL), valor superior ao controle positivo cetoconazol (2,50 mg/mL) e o A. ochraceus (CIM 1,87 mg/mL) estatisticamente significativo ao controle positivo cetoconazol (1,50 mg/mL). No Capitulo 3 foi avaliado as atividades anti-inflamatória, antitumoral e citotóxica do OE. Foram identificados 27 compostos diferentes e os majoritários foram o espatulenol (45,29%), seguido de óxido de cariofileno (12,63%). Para a atividade anti-inflamatória foi utilizada a linhagem de macrófagos RAW 264.7 de camundongos e mensurado o potencial do óleo essencial (OE) das folhas de Eugenia pyriformis Cambess na inibição de produção de óxido nítrico (ON). Para a atividade citotóxica, foram utilizadas as linhagens de células tumorais humanas MCF-7 (adenocarcinoma de mama), NCI-H460 (carcinoma de pulmão), HeLa (carcinoma cervical) e HepG2 (carcinoma hepatocelular) e células não tumorais de fígado suíno (PLP2). Os resultados encontrados para a atividade anti-inflamatória indicaram que o OE foi 5,86 vezes menos ativo (EC50 92,04±8,24 µg/mL) que o controle positivo dexametasona (EC50 15,70±1,1 µg/mL) (p≤0.05). O OE apresentou baixa inibição sobre as células tumorais com GI50 (µg/mL) de 291,51 (MCF-7); 328,00 (NCI-H-460); 337,25 (HeLa) e 270,86 (HepG2) para as linhagens de células tumorais , NCI-H-460, HeLa e HepG2, quando comparado ao controle positivo elipticina (0,91 a 1,91µg/mL). Quanto ao potencial citotóxico em células não tumorais o OE apresentou citotoxicidade moderada (GI50 378,50 μg/mL) quando comparado a elipticina (GI50 3,22 µg/mL). No Capítulo 4 teve por objetivo avaliar o potencial antioxidante do OE e FRs obtidas a partir do fracionamento cromatográfico utilizando como eluentes hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol em diferentes proporções. Vinte e uma frações foram obtidas e reagrupadas conforme fator de retenção (RF), resultando em 10 frações que foram testadas quanto ao potencial antioxidante pelos método DPPH, FRAP e pelo sistema de co-oxidação do beta-caroteno/ácido linoléico. A análise química revelou no OE 59 compostos, cujas classes predominantes foram os monoterpenos (53,64%) e sesquiterpenos hidrocarbonetos (35,06%). Os compostos majoritários encontrados no óleo essencial foram limoneno (16,72%), β–pineno (15,70%) e o trans-cariofileno (10,72%). Quanto ao potencial antioxidante os melhores resultados encontrados foram pelo sistema de co-oxidação β-caroteno/ácido linoléico, onde o óleo essencial mostrou alto potencial de inibição da oxidação com valores entre 72,27 a 68,91 % e as Frações FR1, FR2, FR8 apresentaram potencial intermediário com valores entre 46,89 a 54,52%.
Palavras-chave
uvaia, fenóis totais Penicillium ochrochloron, Aspergillus ochraceus, PLP2 , espatulenol.
Title
BIOLOGICAL ACTIVITIES OF THE CRUDE EXTRACT, ESSENTIAL OIL AND FRACTIONS OBTAINED FROM THE LEAVES OF Eugenia pyriformis Cambess (Myrtaceae)
Abstract
The aim of this study was to investigate the chemical constituents of the crude extract and essential oil (EO) and fractions obtained from the leaves of Eugenia pyriformis and to measure the antioxidant, antimicrobial, anti-inflammatory, anti-tumor and cytotoxic activities. The present work is organized into four chapters. In Chapter 1, the antioxidant potential of crude extract (EB) and fractions of Eugenia pyriformis Cambess leaves obtained by chromatographic fractionation with hexane, dichloromethane, ethyl acetate and methanol were evaluated, obtaining 14 fractions that were evaluated considering antioxidant potential and 5 of them highlighted. The EBEp and the fractions were identified by high performance liquid chromatography using high resolution mass spectrometry (CLAE-ESI / qTOF). The antioxidant activities of EBEp and fractions were investigated by the free radical capture methods (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazil) (DPPH), by the iron reduction method (FRAP), by the co-oxidation system β-carotene / linoleic acid and the determination of total phenols (FT). The compounds Gallic acid (in EBEp and FR1 and FR4), p-cumaric acid (in EBEp and FR5), Ferulic acid (in EBEp), Miricetin (in EBEp and FR2), Quercetin (in EBEp, FR1 and FR2, FR3 and FR4) and Kaempferol (in EBEp and FR2) and p-cumaric acid (in EBEp and FR5). By the DPPH method, EBEp and FR4 showed greater capacity for neutralizing the free radical DPPH with EC50 of 0.144 and 0.187 mg/mL, respectively; by the FRAP method, FR1 showed greater potential in reducing Fe (II) ion (8.202 µM ferrous sulfate/mg sample) when compared to the other fractions and EBEp. The results of the determination of total phenols showed that FR1 and FR3 had a higher content of total phenols (298,810 and 308,929 µg of gallic acid/mg of sample, respectively). Chapter 2 The essential oil (EO) of the leaves of E. pyriformis was obtained by hydrodistillation (3h) and characterized by gas chromatography combined to mass spectrometry (GC/MS), and in the antimicrobial activity of OE against bacteria was evaluated. Gram-positive Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Micrococcus flavus, and Staphylococcus. aureus, and Gram-negative Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and Salmonella typhimurim and fungi Aspergillus fumigatus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Aspergillus versicolor, Penicillium funiculosum, Penicillium ochrochloron, Penicillium verrucosum and Trichoderma viride. The method used was the microdilution in broth determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), minimum bacteriostatic (MBC) and minimum fungistatic (MFC). Chemical identification allowed the characterization of 24 compounds. The majority class was oxygenated sesquiterpenes (84.1%), followed by hydrocarbon sesquiterpenes (14.7%). The major compounds were spatulenol (45.6%) and karyophylene oxide (12.7%). The EO of E. pyriformis leaves showed fungistatic and fungicidal activity against the fungi P. ochrochloron with (MIC 1.87 mg / mL), higher than the positive control ketoconazole (2.50 mg/mL) and A. ochraceus (MIC 1.87 mg/mL) statistically significant to the positive ketoconazole control (1.50 mg/mL). In Chapter 3, the anti-inflammatory, anti-tumor and cytotoxic activities of the OE were evaluated. 27 different compounds were identified and the major ones were spatulenol (45.29%), followed by karyophylene oxide (12.63%). RAW 264.7 macrophage lineage of mice was used for anti-inflammatory activity and the potential of essential oil (EO) from Eugenia pyriformis Cambess leaves was inhibited in the production of nitric oxide (ON). For cytotoxic activity, human tumor cell lines MCF-7 (breast adenocarcinoma), NCI-H460 (lung carcinoma), HeLa (cervical carcinoma) and HepG2 (hepatocellular carcinoma) and non-tumor cells of swine liver ( PLP2). The results found for anti-inflammatory activity indicated that OE was 5.86 times less active (EC50 92.04 ± 8.24µg/mL) than the positive dexamethasone control (EC50 15.70 ±1.1µg/mL ) (p≤0.05). The OE showed low inhibition on tumor cells with GI50 (µg/mL) of 291.51 (MCF-7); 328.00 (NCI-H-460); 337.25 (HeLa) and 270.86 (HepG2) for the tumor cell lines, NCI-H-460, HeLa and HepG2, when compared to the ellipticin positive control (0.91 to 1.91µg/mL). Regarding the cytotoxic potential in non-tumor cells, the EO showed moderate cytotoxicity (GI50 378.50 μg/mL) when compared to ellipticin (GI50 3.22 µg/mL). In Chapter 4, the objective was to assess the antioxidant potential of EO and FRs obtained from chromatographic fractionation using hexane, dichloromethane, ethyl acetate and methanol in different proportions as eluents. Twenty-one fractions were obtained and regrouped according to the retention factor (RF), resulting in 10 fractions that were tested for antioxidant potential by the DPPH, FRAP methods and by the beta-carotene / linoleic acid co-oxidation system.The chemical analysis revealed 59 compounds in the EO, whose predominant classes were monoterpenes (53.64%) and hydrocarbon sesquiterpenes (35.06%). The major compounds found in essential oil were limonene (16.72%), β – pinene (15.70%) and trans-karyophylene (10.72%). Regarding the antioxidant potential, the best results were found by the β-carotene/linoleic acid co-oxidation system, where the essential oil showed high oxidation inhibition potential with values between 72.27 to 68.91% and the FR1, FR2 fractions , FR8 presented intermediate potential with values between 46.89 to 54.52%.
Keywords
Keywords: Uvaia