Pesquisa
Atividades biológicas do óleo resina, óleo essencial e extrato bruto das folhas de Annona muricata
Doutorado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Caroline Zanella Cagnini
Orientador: Zilda Cristiani Gazim
Defendido em: 08/03/2021
Resumo
Embora existam diversas abordagens para a descoberta de moléculas com atividades biológicas, as plantas medicinais são as mais importantes, principalmente pela diversidade. Para a obtenção dessas novas moléculas, existem diversos métodos de extração, entre eles a hidrodestilação, o extrato bruto e a extração por fluído supercrítico. A hidrodestilação, embora muito comum, apresenta como desvantagens a degradação de moléculas pela elevada temperatura utilizada no processo de extração. Os extratos podem ter variações na constituição de acordo com a polaridade do solvente, influenciando no produto final. Já a extração por fluído supercrítico, apesar de ter um custo mais elevado em relação aos outros métodos, é uma técnica que não gera resíduos e que tem elevada pureza e especificidade. A extração com gases supercríticos envolve altas taxas de transferência de massa, em temperaturas relativamente baixas, obtêm-se produtos naturais com alto número de compostos com estrutura mantida pela reduzida oxidação do processo de extração. Annona muricata L. é conhecida popularmente como graviola, possui estudos que demonstram seu potencial terapêutico, porém as folhas foram muito pouco estudadas. Além disso, a busca por compostos biologicamente ativos é um desafio para pesquisa e uma exigência cada vez maior dos consumidores, que buscam por substâncias eficazes e de baixa toxicidade, tanto para o uso em medicamentos, como para a indústria de cosméticos e alimentos. O objetivo deste estudo foi investigar os constituintes químicos do óleo resina, extrato bruto e do óleo essencial obtidos das folhas de A muricata e mensurar as atividades antioxidante e antimicrobiana. O presente trabalho esta organizado em três capítulos. No Capítulo I, foi avaliada a atividade antimicrobiana do óleo resina das folhas da A. muricata, obtido por extração com CO2 supercrítico a 100 bar e 30°C, por 3 h, e a composição química do óleo resina foi determinada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). Foram identificados como compostos majoritários γ-sitosterol (15,7%), seguido de α-tocoferol (13,7%), fitol (13,1%) e ácido hexadecanóico (11,5%). A atividade antimicrobiana do óleo foi testada contra um amplo espectro de fungos e bactérias contaminantes de alimentos, sendo as bactérias as Gram-positivas Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus e Gram- negativas Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella enteritidis, e fungos Aspergillus fumigatus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Aspergillus versicolor, Penicillium funiculosum, Penicillium ochrochloron, Trichoderma viride. O óleo apresentou alta ação bacteriostática contra Bacillus cereus (0,003±0,0002 mg mL-1), Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella enteritidis (0,025±0,0002 mg mL-1) e também elevada atividade bactericida contra Enterobacter cloacae e Pseudomonas aeruginosa com concentração bactericida de 0,005 mg mL-1. Em relação aos fungos avaliados, o óleo apresentou concentrações fungistáticas e fungicidas mínimas inferiores aos controles utilizados. A elevada atividade antimicrobiana do óleo resina pode estar associada aos altos teores de ácido hexadecanóico e de fitol, constituintes que podem interferir na estabilidade celular dos microrganismos. A partir desses resultados, evidenciamos a importância da atividade antibacteriana do óleo resina de A. muricata, visto a busca incenssante por novas moléculas com atividade antimicrobiana. No Capítulo II, a atividade antioxidante foi determinada a partir do óleo resina obtido por fluido supercrítico, utilizando 10 g de folhas frescas, em diferentes condições de pressão (100, 150 e 200 bar) e temperatura de 30 °C, por 3 h. A composição química do óleo resina foi determinada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). Os compostos majoritários encontrados foram os mesmos para as três condições de pressão, sendo eles γ–sitosterol (50,86; 49,28 e 43,97%), vitamina E (23,43; 24,38 e 23,48%) e neofitadieno (9,71; 7,52 e 8,27%), respectivamente para as pressões 100, 150 e 200 bar. Os métodos utilizados para avaliação da atividade antioxidante foram: redução do ferro (FRAP), fenóis totais, sistema de co-oxidação β-caroteno/ácido linoléico e pelo sequestro do radical livre 2,2 difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). Os resultados demonstraram um alto potencial antioxidante pelo método de co-oxidação β-caroteno/ácido linoléico, em todas as condições de pressões analisadas, sendo maiores para as condições de 100 e 150 bar, de 81,44% e 76,84% respectivamente, na concentração de 1,0 mg mL-1. O óleo essencial e o extrato bruto, também foram avaliados no Capítulo III. Foram preparados a partir das folhas secas à temperatura ambiente, sendo que o extrato bruto foi preparado pelo método de maceração dinâmica com esgotamento de solvente utilizando álcool etílico a 96º GL e o óleo essencial foi obtido por hidrodestilação (2h), após foi avaliada a atividade antioxidante do óleo essencial e do extrato bruto das folhas da A. muricata, utilizando as metodologias de redução do ferro (FRAP), sistema de co-oxidação β-caroteno/ácido linoléico, sequestro do radical livre 2,2 difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) e os fenóis totais (FT) pelo método Folin-Ciocalteu. A composição química do extrato bruto e do óleo essencial foram determinados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). A identificação química do óleo essencial resultou em 41 compostos sendo que os majoritários foram alfa cadineno (8,07%), alfa ciperona (7,73%), alfa muuroleno (6,95%), cis-calameno (5,55%) e alfa guaieno (4,09%). Já para o extrato bruto, a identificação resultou em 36 compostos: o 3-eicoseno, (18,02%), ácido hexadecanóico, etil ester (10,15%) e neofitadieno (9,69%), como majoritários. A análise pelo sistema de co-oxidação β-caroteno/ácido linoleico foi o que apresentou maior atividade antioxidante, com teor de inibição da oxidação de 64,70% para o óleo essencial e 69,15% para o extrato bruto. Os resultados obtidos nesse trabalho, foram considerados satisfatórios, e garantem uma promissora aplicação das folhas da A. muricata na indústria farmacêutica, de cosméticos e de alimentos.
Palavras-chave
Annona muricata; γ-sitosterol; ácido hexadecanóico; óleo resina, antioxidante.
Title
Biological activities of resin oil, essential oil and crude extract from the leaves of annona muricata
Abstract
Although there are several approaches to the discovery of molecules with biological activities, medicinal plants are the most important, mainly for their diversity. To obtain these new molecules, there are several extraction methods, including hydrodistillation, crude extract and extraction by supercritical fluid. Hydrodistillation, although very common, presents as disadvantages the degradation of molecules due to the high temperature used in the extraction process. The extracts may vary in composition according to the polarity of the solvent, influencing the final product. On the other hand, extraction by supercritical fluid, despite having a higher cost in relation to other methods, is a technique that does not generate residues and has high purity and specificity. Extraction with supercritical gases involves high rates of mass transfer, at relatively low temperatures, natural products are obtained with a high number of compounds with a structure maintained by the reduced oxidation of the extraction process. Annona muricata L. is popularly known as soursop, has studies that demonstrate its therapeutic potential, but the leaves have been very little studied. In addition, the search for biologically active compounds is a challenge for research and an increasing demand from consumers, who are looking for effective and low toxicity substances, both for use in medicines and for the cosmetics and food industry. The objective of this study was to investigate the chemical constituents of the resin oil, crude extract and essential oil obtained from the leaves of A. muricata and to measure the antioxidant and antimicrobial activities. The present work is organized in three chapters.In Chapter I, the antimicrobial activity of A. muricata leaf resin oil, obtained by extraction with supercritical CO2 at 100 bar and 30 ° C, for 3 h was evaluated, and the chemical composition of the resin oil was determined by gas chromatography coupled to mass spectrometry (CG-MS). Major compounds were identified, γ-sitosterol (15.7%) followed by α-tocopherol (13.7%), phytol (13.1%) and hexadecanoic acid (11.5%). The antimicrobial activity of the oil was tested against a broad spectrum of fungi and bacteria contaminating food, the bacteria being Gram-positive Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Gram-negative Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Salmonella enteritidis, and fungi Aspergillus fumigatus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Aspergillus versicolor, Penicillium funiculosum, Penicillium ochrochloron and Trichoderma viride.The method used was the microdilution in broth determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), minimum bacteriostatic (CBM) and minimum fungistatic (CFM). The oil showed high bacteriostatic action against Bacillus cereus, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa and Salmonella enteritidis, and also high bactericidal activity against Enterobacter cloacae and Pseudomonas aeruginosa with a bactericidal concentration of 0.005 mg mL-1. In relation to the evaluated fungi, the oil presented minimum fungistatic and fungicidal concentrations lower than the controls used. The high antimicrobial activity of resin oil may be associated with high levels of hexadecanoic acid and phytol, major constituents that can destabilize the cellular structures of microorganisms. In Chapter II, the antioxidant activity was determined from the resin oil obtained by supercritical fluid, using 10 g of fresh leaves, under different pressure conditions (100, 150 and 200 bar) and temperature of 30 ° C, for 3 h. The chemical composition of the resin oil was determined by gas chromatography coupled to mass spectrometry (CG-EM). The major compounds found were the same for the three pressure conditions, being γ – sitosterol (50.86, 49.28 and 43.97%), vitamin E (23.43, 24.38 and 23.48%) and neophytadiene (9.71, 7.52 and 8.27%), respectively for pressures 100, 150 and 200 bar. The methods used to assess the antioxidant activity were: iron reduction (FRAP), total phenols, β-carotene / linoleic acid co-oxidation system and by the sequestration of the 2,2-diphenyl-1-picrilhhydrazyl free radical (DPPH). The results demonstrated a high antioxidant potential by the β-carotene / linoleic acid co-oxidation method, in all the pressure conditions analyzed, being higher for the conditions of 100 and 150 bar, of 81.44% and 76.84% respectively , at a concentration of 1.0 mg mL-1. Essential oil and crude extract were also evaluated in Chapter III. They were prepared from the leaves, dried at room temperature, and the crude extract was prepared by the method of dynamic maceration with solvent depletion using 96º GL ethyl alcohol and the essential oil was obtained by hydrodistillation (2h), after which the antioxidant activity of essential oil and crude leaf extract of A. muricata was determined, using methodologies iron reduction (FRAP), β-carotene / linoleic acid co-oxidation system, sequestration of free diphenyl-1- 2,2 radical picrilhidrazil (DPPH) and total phenols (FT) by the Folin-Ciocalteu method. The chemical composition of the crude extract and essential oil were determined by gas chromatography coupled to mass spectrometry (CG-EM). The chemical identification of the essential oil resulted in 41 compounds, the majority of which were alpha-cadinene (8.07%), alpha-cyperone (7.73%), alpha-muurolene (6.95%), cis-calamene (5.55%) and alpha-guaiene (4.09%). For the crude extract, the identification resulted in 36 compounds without which 3-eicosene (18.02%), hexadecanoic acid ethyl ester (10.15%) and neophytadiene (9.69%), were the majority. The analysis by the β-carotene / linoleic acid co-oxidation system showed the highest antioxidant activity, with oxidation inhibition content of 64.70% for essential oil and 69.15% for crude extract. The results obtained in this work were considered satisfactory, and guarantee a promising application of A. muricata leaves in the pharmaceutical, cosmetics and food industries.
Keywords
Annona muricata; γ-sitosterol; hexadecanoic acid; resin oil, antioxidant.