Pesquisa
Atividades biológicas e composição química do óleo essencial e extrato bruto das folhas, flores e frutos de Gallesia integrifolia
Doutorado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Wanessa de Campos Bortolucci
Orientador: Zilda Cristiani Gazim
Defendido em: 27/02/2020
Resumo
Espécies aromáticas e também medicinais podem ser encontradas na Mata Atlântica, entre elas a Gallesia integrifolia (Spreng.) Harms, pertencente à família Phytolaccaceae e nativa do sul das Américas. Conhecida popularmente como Pau d’alho, guararema, na medicina popular é utilizada para o tratamento de gripes, inflamações, ansiedade e no tratamento das micoses. Esta planta apresenta altas concentrações de compostos sulfurados que conferem um odor característico e alto potencial biológico. Dessa forma, diante da escassez de dados científicos sobre o pau d’alho o objetivo deste trabalho foi a obtenção e caracterização química dos óleos essenciais (OEs) e extratos brutos (EBs) das folhas, flores e frutos de G. integrifolia e mensurar o potencial anti-inflamatório, citotóxico, antitumoral, antioxidante, além de verificar a atividade biológica frente larvas do terceiro estádio e pupas de Aedes aegypti, seu efeito carrapaticida e larvicida sobre o carrapato bovino Rhipicephalus microplus. O presente trabalho está organizado em seis capítulos. O óleo essencial (OE) de G. integrifolia foi obtido por hidrodestilação (3h) e os EBs por maceração dinâmica com esgotamento de solvente (etanol 96°GL) e caracterizados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM). No Capítulo 1 o objetivo foi avaliar as atividades anti-inflamatória, antitumoral e citotóxica do OE dos frutos de G. integrifolia. Foram identificados 31 compostos tendo como majoritários os compostos organossulfurados: 2,8-ditianonano (52,8%), trisulfeto de dimetil (15,2%) e lentionina (14,8%). Para a atividade anti-inflamatória foi utilizada a linhagem de macrófagos RAW 264.7 de camundongos e mensurado o potencial do OE na inibição de produção de óxido nítrico (ON). Para a atividade citotóxica, foram utilizadas as linhagens de células tumorais humanas MCF-7 (adenocarcinoma de mama), NCI-H460 (carcinoma de pulmão), HeLa (carcinoma cervical) e HepG2 (carcinoma hepatocelular) e células não tumorais de fígado suíno (PLP2). Os resultados encontrados para a atividade anti-inflamatória indicaram que o OE foi somente 3,48 vezes menos ativo (EC50 54,62 ± 3,69 µg/mL) que o controle positivo dexametasona (EC50 15,70 ± 1,1 µg/mL) (p ≤ 0.05). O OE apresentou baixa inibição sobre as células tumorais com GI50 (µg/mL) de 65,75 (MCF-7); 147,32 (NCI-H-460); 182,13 (HeLa) e 240,47 (HepG2) para as linhagens de células tumorais, NCI-H-460, HeLa e HepG2, quando comparado ao controle positivo elipticina (0,91 a 1,91µg/mL). Quanto ao potencial citotóxico em células não tumorais o OE não apresentou citotoxicidade (GI50 = >400 μg/mL) quando comparado a elipticina (GI50 3,22 µg/mL); o índice de seletividade (SI 1,66 à 6,08) indicou que o OE apresenta baixa toxicidade e seletividade para as células tumorais. Os Capítulos 2 e 3 tiveram por objetivo avaliar o potencial antioxidante dos OEs e EBs obtidos a partir das folhas, flores e frutos de G. integrifolia, pelos métodos de sequestro dos radicais livres 2,2 difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), redução férrica/poder antioxidante (FRAP), pelo sistema de co-oxidação do beta-caroteno/ácido linoléico e determinação de fenóis totais (FT). A análise cromatográfica revelou a presença de compostos organosulfurados como classe predominante, sendo 79,9% nas folhas, 82,4% nas flores e 98,7% nos frutos. Quanto ao potencial antioxidante os melhores resultados dos OEs foram pelo sistema de co-oxidação β-caroteno/ácido linoléico, apresentando alto potencial de inibição da oxidação de 76,5% frutos, 70,3% folhas e 70,3% flores na concentração de 1,0 mg/mL. Para os EBs os melhores resultados também foram pelo sistema de co-oxidação β-caroteno/ácido linoleico, destacando o EB das flores com potencial de inibição de 130,61 à 86,63% nas concentrações de 1,0 à 0,25 mg/mL, respectivamente. O EB das flores e frutos também apresentaram maior capacidade de neutralização do radical livre DPPH com EC50 de 0,37 e 0,50 mg/mL, respectivamente e mostraram a presença de fenóis totais com 47,53 (folhas), 58,50 (frutos) e 32,84 (flores) µg de ácido gálico/mg de amostra. Estes resultados justificam a presença de metil éster ácido linoleico (34,7%) e o fitol (28,66%) nas folhas e vitamina E, 19,1% e 16,3% nas flores e frutos, além da presença dos organossulfurados nas flores (10,8%) e nos frutos (6,7%). No Capítulo 4 foi avaliada a atividade dos EBs nas larvas e pupas do A. aegypti utilizando a técnica de imersão. Também foi determinado a atividade anticolinesterase pelo método bioautográfico. Os resultados indicaram que o EB das flores apresentou maior atividade com LC99.9 para larvas (0,032 mg/mL) e pupas (0,969 mg/mL) e maior inibição da enzima acetilcolinesterase (0,00019 mg/mL). Além disso o EB das flores foi 35,6 vezes mais ativo que o controle themephos (1,140 mg/mL). A alta atividade do EB das flores deve-se a presença dos organosulfurados nas flores (20,3%), quando comparados com os frutos (8,6%) e folhas (0,8%). Os resultados encontrados indicam que os EBs das folhas, frutos e principalmente das flores de G. integrifolia são potenciais bioinseticidas alternativos para o controle de larvas e pupas de A. aegypti. No Capítulo 5 foi determinado as atividades acaricida e larvicida dos EBs sobre o R. microplus pelo teste de imersão de adultos e larvas. Os resultados indicaram maior atividade larvicida dos EBs das flores (LC99.9 = 15,84 mg/mL) e dos frutos (LC99.9 = 16,15 mg/mL), quando comparado aos extratos brutos das folhas (LC99.9 = 18,32 mg/mL). E para a atividade sobre as fêmeas adultas ingurgitadas todos os EBs foram efetivos, destacando as flores (LC99.9 = 46,34 mg/mL), visto que em 25 mg/mL manteve a eclodibilidade de somente 1,0% dos ovos e com a eficiência do produto de 96,9% na concentração de 12,5 mg/mL. Este alto potencial verificado nas flores deve-se provavelmente a presença do organosulfurado disulfide, bis(2-sulfhydryl ethyl) (12,8%), que foi verificado somente nestas. O Capítulo 6 contempla a avaliação da eficiência dos EBs e OEs das folhas, flores e frutos de G. integrifolia no controle das larvas do carrapato bovino, pelo teste ex situ avaliando a atividade sobre as larvas no ciclo de vida livre em condições seminaturais. O teste foi desenvolvido em vasos contendo Brachiaria decumbens onde foram depositados 30mg de larvas de carrapato que receberam a CL99,9 dos EBs e OEs. Os resultados indicaram que os OEs foram mais ativos com CL99,9 de 0,08 mg/mL para as flores, 0,23 mg/mL (frutos) e 2,15 mg/mL (folhas), quando comparados com os EBs (flor 15,84 mg/mL, frutos 16,15 mg/mL e folhas 18,32 mg/mL), justificando os altos teores do organosulfurados nos OEs das folhas (99,7%), flores (99,7%) e frutos (99,3%), enquanto que os EBs apresentaram 21,8% nas flores e 10,7% nos frutos e ausência nas folhas. Estes estudos concluem que a espécie G. integrifolia possui biomoléculas, que podem vir a ser uma alternativa biotecnológica na substituição ou associação a antioxidantes sintéticos, assim como substituir os acaricidas e larvicidas químicos reduzindo os efeitos tóxicos que estes causam ao meio ambiente.
Palavras-chave
Aedes aegypti, Brachiaria decumbens, células não tumorais porcinas (PLP2), Disulfide, bis(2-sulfhydryl ethyl), Organosulfurados, Rhipicephalus microplus.
Title
BIOLOGICAL ACTIVITIES AND CHEMICAL COMPOSITION OF ESSENTIAL OIL AND CRUDE EXTRACT FROM LEAVES, FLOWERS AND FRUITS OF Gallesia integrifolia
Abstract
Aromatic and also medicinal species can be found in the Atlantic Forest, including Gallesia integrifolia (Spreng.) Danos, belonging to the Phytolaccaceae family and native to the South of the Americas. Popularly known as pau d’alho, guararema, folk medicine is used to treat complaints, inflammation, anxiety and treatment of mycoses. This plant has high concentrations of sulfur compounds that give a characteristic odor and a high biological potential. Thus, in view of the scarcity of scientific data on lead stick or the objective of this work was to use and characterize chemical products (EO) and crude extracts (CE) of leaves, flowers and fruits of G. integrifolia and measure the anti- inflammatory, cytotoxic, antitumor, antioxidant, in addition to checking the biological activity against third stage larvae and pupae of Aedes aegypti, their tick and larvicidal effect on the bovine tick Rhipicephalus microplus. The present work is organized in six chapters. The essential oil (EO) of G. integrifolia was used by hydrodistillation (3h) and the EBs by maceration and used with oil exhaustion (ethanol 96 ° GL) and characterized by gas chromatography coupled with mass spectrometry (CG/MS). In Chapter 1, the objective was assessed as anti-inflammatory, anti-tumor and cytotoxic activities of the EO of the fruits of G. integrifolia. 31 compounds were used with the main organosulfurized organic compounds: 2,8-dithianonane (52.8%), dimethyl trisulfide (15.2%) and lentionin (14.8%). For anti-inflammatory activity, a strain of mouse RAW 264.7 macrophages was used and measured or potential of OE in inhibiting nitric oxide (NO) production. For cytotoxic activities, human tumor cell lines MCF-7 (breast adenocarcinoma), NCI-H460 (lung carcinoma), HeLa (cervical carcinoma) and HepG2 (hepatocellular carcinoma) and non-tumor cells of swine liver (PLP2) were used). The results found for anti-inflammatory activities indicated that OE were only 3.48 times less active (EC50 54.62 ± 3.69 µg/mL) that control positive positivity (EC50 15.70 ± 1.1 µg/mL) (p ≤ 0.05). The OE showed low inhibition on tumor cells with a GI50 (µg/mL) of 65.75 (MCF-7); 147.32 (NCI-H-460); 182.13 (HeLa) and 240.47 (HepG2) for the tumor cell lines, NCI-H-460, HeLa and HepG2, when compared to the ellipticin positive control (0.91 to 1.91µg/mL). Regarding the cytotoxic potential in non-tumor cells or EO, it does not present cytotoxicity (GI50 = > 400 μg/mL) when observing an ellipticin (GI50 3.22 µg/mL); the selectivity index (SI 1.66 to 6.08) indicates that EO has low toxicity and selectivity for tumor cells. Chapters 2 and 3 aimed to evaluate the antioxidant potential of EO and CE, from the leaves, flowers and fruits of G. integrifolia, by the method of sequestering free radicals 2,2 diphenyl-1-picrilhidrazil (DPPH), reduction iron/antioxidant power (FRAP), by the beta-carotene/linolenic acid co-oxidation system and determination of total phenols (TP). Chromatographic analysis revealed the presence of organosulfur compounds as the predominant class, with 79.9% in leaves, 82.4% in flowers and 98.7% in fruits. How much is the antioxidant potential of the best OE results for the β-carotene/linoleic acid co-oxidation system, it has a high oxidation inhibition potential of 76.5% fruits, 70.3% leaves and 70.3% flowers in concentration of 1.0 mg/mL. For CE, the best results were also due to the β-carotene/linoleic acid co-oxidation system, highlighting or CE of the flowers with a potential inhibition of 130.61 to 86.63% in the analyzes of 1.0 to 0.25 mg/mL, respectively. The CE of flowers and fruits also showed greater capacity to neutralize the free radical DPPH with EC50 of 0.37 and 0.50 mg/mL, respectively and showed the presence of complete phenols with 47.53 (leaves), 58.50 (fruits) and 32.84 (flowers) µg of gallic acid/mg of sample. These results justify the presence of linoleic acid (34.7%) and phytol (28.66%) in leaves and vitamin E, 19.1% and 16.3% in flowers and fruits, in addition to the presence of organosulfides in flowers (10.8%) and fruits (6.7%). In Chapter 4, the activity of CE in larvae and pupae of A. aegypti was evaluated using the immersion technique. Anticholinesterase activity was also determined by the bioautographic method. The results indicated that the CE of the flowers showed greater activity with LC99.9 for larvae (0.032 mg/mL) and pupae (0.969 mg/mL) and greater inhibition of the enzyme acetylcholinesterase (0.00019 mg/mL). In addition, the CE of the flowers was 35.6 times more active than the themephos control (1.140 mg/mL). The high activity of the EB of the flowers is due to the presence of organosulfides in the flowers (20.3%), when compared with the fruits (8.6%) and leaves (0.8%). The results found indicate that the EBs of the leaves, fruits and mainly of the flowers of G. integrifolia are potential alternative bioinsecticides for the control of larvae and pupae of A. aegypti. In Chapter 5, the acaricidal and larvicidal activities of CE on R. microplus were determined by the immersion test of adults and larvae. The results indicated greater larvicidal activity of the CE of the flowers (LC99.9 = 15.84 mg/mL) and of the fruits (LC99.9 = 16.15 mg/mL), when compared to the crude leaf extracts (LC99.9 = 18.32 mg/ml). And for the activity on engorged adult females, all CE were effective, highlighting the flowers (LC99.9 = 46.34 mg/mL), since at 25 mg/mL maintained the hatchability of only 1.0% of the eggs and with a product efficiency of 96.9% at a concentration of 12.5 mg/mL. This high potential verified in the flowers is probably due to the presence of the organosulfur disulfide, bis (2-sulfhydryl ethyl) (12.8%), which was verified only in these. Chapter 6 contemplates the evaluation of the efficiency of the CE and EO of the leaves, flowers and fruits of G. integrifolia in the control of the larvae of the bovine tick, by the ex situ test evaluating the activity on the larvae in the free life cycle under semi-natural conditions. The test was developed in pots containing Brachiaria decumbens where 30 mg of tick larvae were deposited and received the CL99.9 of CE and EO. The results indicated that EO were more active with CL99.9 of 0.08 mg/mL for flowers, 0.23 mg/mL (fruits) and 2.15 mg/mL (leaves), when compared with CE (flower 15.84 mg/mL, fruits 16.15 mg/mL and leaves 18.32 mg/mL), justifying the high levels of organosulfides in leaf EO (99.7%), flowers (99.7%) and fruits (99.3%), while CE presented 21.8% in flowers and 10.7% in fruits and absence in leaves. These studies conclude that the G. integrifolia species has biomolecules, which may prove to be a biotechnological alternative in the substitution or association with synthetic antioxidants, as well as replacing chemical mites and larvicides, reducing the toxic effects they cause to the environment.
Keywords
Aedes aegypti, Brachiaria decumbens, Porcine non-tumor cells (PLP2), Disulfide, bis (2-sulfhydryl ethyl), Organosulfides, Rhipicephalus microplus.