Pesquisa
Caracterização taxonômica e da diversidade genética de isolados de leveduras associadas ao cultivar de uva ‘bordô’ (vitis labrusca).
Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Márcio Cilião Filho
Orientador: Nelson Barros Colauto
Defendido em: 27/08/2015
Resumo
Entre as cultivares de Vitis labrusca, a ‘Bordô’ tem se destacado por sua elevada adaptação às condições climáticas brasileiras, por apresentar excelente fertilidade e apreciável tolerância a doenças, sendo utilizadas basicamente para produção de vinhos e sucos. Esta uva apresenta alta concentração de matéria corante, motivo principal de sua significativa difusão, por originar sucos de cor intensa, que servem para a melhoria da cor dos produtos à base das variedades 'Isabel' e de 'Concord'. No aspecto nutricional, as uvas estão entre as frutas que se destacam como fonte de compostos fenólicos, com importantes características biológicas, deste modo constitui em uma fonte promissora para a bioprospecção de microrganismos associados com potencial aplicação biotecnológica em diferentes áreas de interesse. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo a caracterização taxonômica e da diversidade genética de isolados de leveduras associadas ao cultivar ‘bordô’ (Vitis labrusca), coletadas em cinco regiões produtoras do Paraná e seis do Rio Grande do Sul, pela professora Dra. Maria Helena Pelegrinelli Fungaro, pesquisadora do Departamento de Biologia Geral da Universidade Estadual de Londrina (UEL). Foram utilizadas as cascas das uvas, as quais foram colocadas em meio DRBC e DG18, após o crescimento de colônias de leveduras, foram repicadas seis colônias por placa as quais foram crescidas em meio ágar batata dextrose incubadas a 25°C e posteriormente isoladas em 50% de CDB e 50% de glicerol. A caracterização dos isolados foi inicialmente feita pela análise das características morfológicas das colônias, desse modo de acordo com o agrupamento morfológico, alguns isolados representantes de cada morfotipo foram selecionados para serem identificados taxonômicamente (gênero). Para os estudos de diversidade genética dos isolados, foram utilizadas as técnicas de BOX-PCR e PCR-RFLP da região ITS1-5,8S-ITS2 do DNA ribossomal. Com o uso da técnica de BOX-PCR foi possível diferenciar os genótipos de leveduras, sendo possível também observar que na maioria dos agrupamentos obtidos, cada grupo era formado por apenas um ou dois isolados, demonstrando uma alta diversidade genética entre os mesmos. Os isolados pertencentes a cada grupo são provenientes de regiões distintas de isolamento. A técnica de PCR-RFLP nos permitiu analisar o polimorfismo existente entre indivíduos de uma população com base em uma região mais restrita e conservada em termos evolutivos, sendo utilizada principalmente para diferenciar isolados ao nível de gênero, sendo encontrados 31,25% de leveduras do gênero Cryptococcus, 25% do gênero Pichia e Candida, 12,5% do gênero Dekkera e 6,25% do gênero Saccharomyces. Os testes de atividade enzimáticas para pectinase, foram satisfatórios pois 33,33% dos isolados analisados apresentaram índices enzimáticos (IE) acima de 2,0. Desta forma, foi possível verificar que os isolados de leveduras obtidos apresentam uma ampla diversidade genética a qual é de grande utilidade para os estudos de bioprospecção dos mesmos, seja na produção de enzimas, como a pectinase, e outras moléculas bio-ativas de interesse em diferentes aplicações biotecnológicas.
Palavras-chave
biotecnologia, uva ‘Bordô’ (Vitis labrusca), leveduras, taxonomia.
Title
Taxonomic and genetic characterization of the yeasts isolates associated to the Bordeaux grape variety (Vitis labrusca)
Abstract
Among the Vitis labrusca varieties, the Bordeaux has been noted for its high adaptability to the environmental Brazilian climate conditions and to show an excellent fertility and an appreciated tolerance to diseases. It has been used basically to the productions of vines and juices. This grape shows an elevated concentration of staining material, the principal reason to its significant diffusion, for originating intense color juices which improve the product color based on “Isabel” and “Concord”. In the nutritional aspect, the grapes are among the fruits that stand out as a source of phenolic compounds with important biological characteristics, thus constituting also a promising source for bioprospecting microorganisms associated with potential biotechnological applications in different areas of interest. Thus, this study aimed to characterize the taxonomic and genetic diversity of yeast isolates associated with the cultivar “Bordeaux” (Vitis labrusca), collected in five producing regions of Paraná state and six from the Rio Grande do Sul state, by Professor Dr. Maria Helena Pelegrinelli Fungaro, Department of General Biology, State University of Londrina (UEL). The skins of the grapes were used, which were placed in the DRBC and DG18 media. After growth of yeast colonies, six colonies were picked per plate which were grown on potato dextrose agar medium (PDA HIMEDIA) incubated at 25 ° C and then isolated in 50% CDB and 50 % glycerol. The characterization of the isolates was initially made by analyzing the morphological characteristics of the colonies, thus according to the morphological grouping, some isolates representatives of each morphotype were chosen to be identified taxonomically (genus). For studies of genetic diversity of isolates, the techniques of BOX- PCR and PCR-RFLP of ITS1-5.8S - ITS2 region of the ribosomal DNA were used. Using the BOX- PCR was possible to differentiate the selected yeast genotypes and also verify that in most of the groups obtained, each group consisted of only one or two isolates, demonstrating a high genetic diversity between them. Moreover, isolates belonging to each group are derived from different regions of isolation. The PCR-RFLP of ITS1-5.8S - ITS2 region technique has enabled us to analyze the existing polymorphism between individuals in a population based on a more DNA restricted region and conserved in evolutionary terms, being used mainly to differentiate isolates in the genus level. With the use of PCR-RFLP technique 31.25% of the yeast were identified as belonging to the genus Cryptococcus, 25% to Pichia and Candida, 12.5 % to Dekkera and 6.25 % to the Saccharomyces genus. The enzymatic activity tests for pectinase were satisfactory because 33.33 % of the analyzed isolates presented enzymatic index (EI) above 2.0. Thus, it was verified that the obtained yeast strains present a wide genetic diversity which is very useful for bioprospecting studies as in the production of enzymes, such as pectinase, and other bio-active molecules of interest in different biotechnological applications.
Keywords
biotechnology, ‘Bordeaux’ grape (Vitis labrusca), yeasts, taxonomy.