Pesquisa
Efeitos da infecção pelo Toxoplasma gondii sobre as células caliciformes e neurônios submucosos do jejuno de ratos
Mestrado em Ciência Animal com Ênfase em Produtos Bioativos
Autor: Marcelo Biondaro Góis
Orientador: Débora de Mello Gonçales Sant’Ana
Defendido em: 12/11/2010
Resumo
O objetivo deste trabalho foi avaliar as alterações causadas pela infecção por oocistos Toxoplasma gondii (cepa ME-49, genótipo II) em células caliciformes e em neurônios do plexo submucoso presentes no jejuno de ratos. Foram utilizados vinte ratos (Rattus norvegicus) Wistar machos, com sessenta dias de idade, pesando 258,58±13,64g. Os animais foram sorteados em dois grupos experimentais: GC (n=10) grupo controle, administrado via oral 1 mL de PBS e GI (n=10) inoculados via oral com 500 oocistos de T. gondii. Acompanhou-se o peso e presença de anticorpos séricos anti-T. gondii dos animais de ambos os grupos pelo Método de Aglutinação Direta (MAD). Após trinta e seis dias, os animais foram submetidos à eutanásia em seguida realizada laparotomia pela linha média, os segmentos intestinais foram retirados, lavados em solução salina 0,9% e, fixados para posteriores realizações de técnicas histológicas, histoquímica e imunohistoquímica. Diferentes órgãos foram destinados a realização da bioprova utilizando camundongos. Para análise histológica um anel de três centímetros a partir da flexura duodeno-jejunal de cinco animais de cada grupo foi coletado e submetido a rotina histológica. Foram obtidos cortes transversais semi-seriados de 4μm, corados com periodic acid shiff (PAS) + solução de diástase - para detecção de mucinas neutras e sialomucinas lábeis; alcian-blue (AB) pH 2,5 - para detecção de sialomucinas e sulfomucinas; e alcian-blue (AB) pH 1,0 - para detecção de sulfomucinas. Para cada 2000 mil enterócitos, calculou-se a proporção de células caliciformes evidenciadas pelas técnicas de PAS, AB pH 2,5 e AB pH 1,0. O jejuno de outros cinco animais de cada grupo foi submetido a técnica histoquímica da NADH-diaforase e a coloração pela técnica de Giemsa. Preparados totais foram obtidos com auxílio de estereomicroscópio com transiluminação, a partir da tela submucosa, para exposição dos neurônios do plexo submucoso pela remoção das túnicas muscular e mucosa por dissecção. Foram contados os neurônios presentes em 50 campos microscópicos para cada animal, grupo e técnica. Foi também contado o número de gânglios nesta mesma área e o número médio de neurônios por gânglio em 50 gânglios. Foram evidenciados os neurônios imunorreativos ao peptídeo intestinal vasoativo (VIP-IR) e os neurônios presentes em vinte campos microscópicos com imunorreatividade de cada animal de ambos os grupos foram contados. Para todas as técnicas foi realizada a análise morfométrica em 100 neurônios. A presença de anticorpos anti-T. gondii no GI foi verificada a partir de 7 dias após a infecção (dpi) apresentando títulos crescentes até o final do experimento. A bioprova confirmou a infecção do GI, através da soroconversão e o reisolamento do parasito. A infecção pelo T. gondii levou a redução da proporção de células caliciformes em relação ao número de enterócitos de 37% para 30% (p<0,05). Aquelas produtoras de muco neutro (PAS positivas) reduziram de 21% para 18,6% (p<0,001), enquanto as secretoras de sulfomucinas (AB-pH 1,0 positivas) diminuíram de 9,7% nos animais do GC para 5,7% nos animais do GI (p<0,05). A análise quantitativa dos neurônios submucosos demonstrou que a população neuronal total sofreu redução de 18,2% (p<0,05) e nas subpopulações VIP-IR e NADH-dp a redução foi de 28,3% (p<0,05) e 44,7% (p<0,05) respectivamente. A análise morfométrica destes neurônios revelou atrofia nos animais infectados pelo T. gondii. Conclui-se que a infecção induzida por oocistos de T. gondii (ME-49) levou a alteração da dinâmica de produção e secreção do muco, morte e hipertrofia de neurônios do plexo submucoso do jejuno de ratos
Palavras-chave
células caliciformes, neurônios entéricos, peptídeo intestinal vasoativo, plexo submucoso, Toxoplasma gondii
Title
The effects of the infection with Toxoplasma gondii on goblet cells and submucous neurons in the jejunum of rats
Abstract
This study evaluates the changes caused by the infection with Toxoplasma gondii oocysts (ME49, genotype II) in neurons in the submucosal plexus and goblet cells in the jejunum of rats. Twenty-four male Wistar rats (Rattus norvegicus), 60 days of age, 258.58±13.64g were divided into two experimental groups: Control Group (CG) (n=10), received 1 mL of PBS orally and Inoculated Group (IG) (n=10), orally inoculated with 500 T. gondii oocysts. Body weight and presence of anti-T. gondii antibodies in the serum of rats in both groups were measured by Direct Agglutination Test (DAT). After 36 days, the rats were euthanized and midline laparotomy was performed. Intestinal segments were removed, washed with 0.9% sodium chloride solution, and fixed for histology, histochemistry and immunohistochemistry. Different organs were assigned to mouse bioassay. A 3-cm ring of the duodenojejunal flexure from 5 animals in each group were collected and subjected to histological examination. Semi-serial 4μm-thick transverse sections were stained with Hematoxylin and Eosin (HE); Periodic Acid Shiff (PAS) + diastase solution – for the detection of sialomucins and sulphomucins; and Alcian-Blue (AB) pH 1.0 – for the detection of sulphomucins. Eighty measurements were performed in semi-serial sections evenly distributed in the intestinal circumference. The proportion of goblet cells evidenced by PAS, AB pH 2.5 and AB pH 1.0 was calculated for every 2000 enterocytes. Whole mounts were obtained, via a Stereo Microscope with Transillumination, from the submucosa to show the submucous plexus by removing the tunica muscularis and the tunica mucosa for dissection. Whole mounts were Giemsa stained and the neurons in 120 microscopic fields for each animal counted. The number of ganglia within the same area and the mean number of neurons by ganglion in 50 ganglia were also counted. The subpopulation of positive NADH-diaphorase (NADH-dp) was evidenced and the neurons and ganglia in 50 microscopic fields were quantified. The neurons/ganglion density in 50 ganglia was quantified. Vasoactive intestinal peptide immunoreactive neurons (VIP-IR) were evidenced. Neurons in 20 microscopic fields presenting immunoreactivity in each animal from both groups were counted. Morphometric analysis in 100 neurons was performed for every technique used. The presence of anti-T. gondii antibodies in IG was verified from Day 7 after infection (dpi), presenting increasing titers until the end of the experiment. Bioassay confirmed the infection in IG through seroconversion and reisolation of the parasite. The infection with T. gondii led to the reduction of the proportion of goblet cells in relation to the enterocytes from 37% to 30% (p<0.05). Neutral mucus-producing cells (PAS-positive) reduced from 21% to 18.6% (p<0.001), whereas sialomucins-secreting cells (AB-pH 1.0 positive) reduced from 9.7%, in all animals in CG, to 5.7%, in those from IG (p<0.05). Quantitative analysis of submucosal neurons showed that the total neuronal population reduced 18.2% (p<0.05) and the VIP-IR and NADH-dp populations reduced 28.3% (p<0.05) and 44.7% (p<0.05), respectively. Morphometric analysis of these neurons revealed atrophy in the animals infected with T. gondii. The infection induced by T. gondii (ME49) oocysts was concluded to result in the change of the dynamics of production and secretion of mucus, death and atrophy of neurons in the submucous plexus
Keywords
goblet cells, enteric neurons, vasoactive intestinal peptide, submucous plexus, Toxoplasma gondii