Pesquisa
Congelação de espermatozoides equinos com a adição de extrato de Eugenia uniflora L (pitangueira) ao meio diluidor comercial
Mestrado em Ciência Animal com Ênfase em Produtos Bioativos
Autor: Daniel Campos Giosa
Orientador: Rosiara Rosaria Dias Maziero
Defendido em: 25/03/2021
Resumo
As biotecnologias da reprodução utilizadas em equinos estão em constante aprimoramento e a criopreservação espermática é uma das mais utilizadas, por permitir o melhor aproveitamento do ejaculado, otimizando a disseminação de material genético de animais geneticamente superiores. Porém, esta biotécnica induz a alterações às células espermáticas, decorrente da produção exacerbada de espécies reativas do oxigênio (ERO). As ERO quando em excesso, promovem lesão a membrana plasmática do espermatozoide, diminuindo a sua viabilidade. Neste sentido, antioxidantes atuam no combate aos efeitos nocivos provocados pelos radicais livres, proporcionando melhor qualidade do sêmen fresco, refrigerado e congelado. A Eugenia uniflora L, popularmente conhecida como (pitangueira), apresenta compostos fenólicos com ação antioxidante, inibindo a peroxidação lipídica e a lipoperoxidação in vitro. Estes compostos desempenham um papel importante, agindo tanto na etapa de iniciação como na propagação do processo oxidativo. Entretanto, não existem relatos na literatura sobre a utilização do extrato de pitanga como agente antioxidante adicionado ao meio diluidor para sêmen equino. Assim, este trabalho teve como objetivo estudar os efeitos da fração solúvel em etanol das folhas da E. uniflora adicionado ao meio diluidor comercial para melhorar a cinética e a viabilidade do sêmen equino criopreservado. Foram utilizados quatro garanhões da raça quarto de milha, entre 5 e 15 anos de idade selecionados de acordo com o escore de condição corporal e exame andrológico. Foram colhidas 3 amostras de ejaculados, utilizando vagina artificial, com análise imediata quanto a motilidade, vigor espermático, morfologia espermática e integridade de membrana plasmática, avaliação subjetiva utilizando microscopio. Após avaliação, os ejaculados foram diluídos conforme os grupos experimentais: 1) grupo controle: diluidor BotuCrio®; 2) grupo 1: diluidor BotuCrio®, com a adição de extrato de E. uniflora na concentração de 1 mg para cada 120 x 106 espermatozoides por mL e 3) grupo 2: diluidor BotuCrio®, com a adição de extrato de E. uniflora na concentração de 2 mg para cada 120 x 106 espermatozoides por mL. Depois de diluido, as amostras foram submetidas a congelação. Após a descongelação em banho-maria a 46ºC por 12 segundos, as amostras foram analisadas em sistema computadorizado (CASA) para avaliação da cinética espermática. De acordo com as análises realizadas, apenas o parâmetro de porcentagem de espermatozoides com movimento médio diferenciou entre os grupos, com o controle apresentando maior porcentagem em relação aos grupos 1 e 2. Pôde-se concluir então, que a adição da fração solúvel em etanol das folhas da E. uniflora ao ejaculado equino, não altera a cinética espermática pós-descongelação.
Palavras-chave
Análises espermáticas. Antioxidante. Criopreservação. Pitanga. Radicais livres. Sêmen equino.
Title
Freezing of equine sperm with the addition of extract of Eugenia uniflora L (pitanga) to the commercial diluting medium
Abstract
The biotechnologies of reproduction used in horses are constantly improving and sperm cryopreservation is one of the most used, as it allows the best use of ejaculate, optimizing the dissemination of genetic material from genetically superior animals. However, this biotechnology induces alterations to cells, leading to the exacerbated production of reactive oxygen species (ROS). In excess, ROS damage the sperm's plasma membrane, decreasing its viability. In this sense, antioxidants act to combat the harmful effects caused by free radicals, providing better quality of fresh, chilled and frozen semen. Eugenia uniflora L (pitanga) has phenolic compounds with antioxidant action, inhibiting lipid peroxidation and lipoxygenase in vitro. These compounds play an important role, acting both in the initiation stage and in the propagation of the oxidative process. However, there are no reports in the literature on the use of pitanga extract as an antioxidant agent added to the diluting medium for equine semen. Thus, this work aimed to study the effect of E. uniflora L (pitanga) added to the commercial diluting medium to improve the kinetics and viability of cryopreserved equine semen. Four stallions of different breeds were used, selected according to the body condition score and andrological examination. Five samples of ejaculates were collected, using an artificial vagina, with immediate analysis for motility, sperm vigor, sperm morphology and plasma membrane integrity. Then, the ejaculates were diluted according to the experimental groups: 1) control group: BotuCrio® Diluidor; 2) group 1: BotuCrio® Diluter, with the addition of Eugenia uniflora L extract at a concentration of 1 mg for each 120 x 106 sperm per mL and 3) group 2: BotuCrio® Diluter, with the addition of E. uniflora L extract at a concentration of 2 mg for each 120 x 106 sperm per ml. Then, the samples were subjected to freezing. After thawing, the samples were analyzed in a computerized system (CASA) to evaluate sperm kinetics and to evaluate cell viability by flow cytometry. According to the analyzes performed, only the parameter of percentage of sperm with medium movement differed between the groups, with the control group presenting a higher percentage (P˂0.05) in relation to groups 1 and 2. It was concluded that the addition of the ethanol-soluble fraction of the leaves of E. uniflora L (pitanga) to the equine ejaculate does not alter the kinetics and sperm viability after thawing.
Keywords
Cryopreservation. Equine semen. Pitanga. Reactive oxygen species. Sperm analysis.