Pesquisa
Criopreservação de basidiomicetos
Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Lienine Luiz Zaghi Junior
Orientador: Nelson Barros Colauto
Defendido em: 26/04/2013
Resumo
Certos basidiomicetos apresentam potencial gastronômico, medicinal e biotecnológico. A preservação é feita frequentemente por meio de repique contínuo onde parte do fungo é sucessivamente transferido com risco de contaminações por outros microrganismos e ácaros. Além disso, existe a possibilidade de ocorrer danos genéticos com perda de características de interesse biotecnológico. A criopreservação é uma alternativa de preservação de longo prazo com reduzido risco de contaminações e danos celulares significativos. Para criopreservação de fungos frequentemente são utilizados substâncias com potencial quimiocrioprotetor associados ou não a agentes mecanocrioprotetores. O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade de basidiomicetos após criopreservação a -75 ˚C e a -20 ˚C previamente cultivados em grãos de trigo ou ágar-dextros-batata ou ágar-extrato de malte com adição de glicose ou sacarose no meio de cultivo e na solução de imersão. O trabalho foi dividido em quatro partes. A primeira foi a criopreservação de basidiomicetos em grãos de trigo (GTD) imersos ou não em solução de glicose a 4%, à 75 ˚C, por um ano. Os resultados mostraram viabilidade micelial ≥ 80% em todos os tratamentos diferindo apenas o tempo de recuperação. A segunda parte foi a criopreservação de Agaricus blazei com glicose a 3% ou 6% ou sacarose a 10% ou 20% adicionado em ágar-dextrose-extrato de batata (ADB) ou ágar-extrato de malte (AEM) e imersos em solução crioprotetora de glicose a 4% ou sacarose a 15% no criotubo, criopreservados a -75 ˚C e a -20 ˚C, por quatro meses. Os resultados mostraram viabilidade micelial ≥ 80% em todos os tratamentos criopreservados a -75 ˚C, porém quando criopreservado a -20 ˚C não houve viabilidade micelial. A terceira parte foi a criopreservação de A. blazei em ADB ou AEM com diferentes concentrações de glicose ou sacarose na solução de imersão, criopreservados -75 ˚C e a -20 ˚C, por quatro meses. Os resultados mostraram que para criopreservação a -75 ˚C, após 4 meses, usando meio de cultivo de ADB, a viabilidade micelial ficou na faixa de concentração de líquido de imersão em criotubo de 15% a 27,5% de glicose e para AEM foi de 5%, 7,5%, 15%, 20%, 32,5% e 35%. Para criopreservação a -75 ˚C, após 4 meses, usando meio de cultivo de ADB, a viabilidade micelial ficou na faixa de concentração do líquido de imersão em criotubo de 20% a 45% de sacarose e para AEM foi de 5%, 20% e 22,5%. Para criopreservação a -20 ˚C, após 4 meses, usando meio de cultivo de ADB, a viabilidade micelail ficou na faixa de concentração líquido de imersão em criotubo de 10% e 32,5% de glicose e para AEM foi de 32,5%. Para criopreservação a -20 ˚C, após 4 meses, usando meio de cultivo de ADB, a viabilidade micelial ficou na faixa de concentração líquido de imersão em criotubo de 32,5% de sacarose e para AEM foi de 22,5%. A quarta parte foi a criopreservação de A. blazei em GTD ou ADB com 10% ou 20% de sacarose no meio de cultivo imersos ou não, em solução de zero, 15%, 30% ou 45% de sacarose na solução de imersão, criopreservados a -75 ˚C e a -20 ˚C, por quatro meses. Os resultados mostraram que a criopreservação a -20 °C, após 4 meses, somente foi efetiva para grãos com 30% a 45% de sacarose na solução de imersão do criotubo sem açúcar no meio de cultivo, ou 10% de sacarose no meio de cultivo e 45% de sacarose em solução no criotubo, ou 20% de sacarose no meio de cultivo e 0%, 15% ou 45% de sacarose em solução no criotubo. Para o meio de cultivo ADB foi efetivo para 10% de sacarose no meio de cultivo e 30% de sacarose em solução no criotubo, ou 20% no meio de cultivo e 15% ou 45% de sacarose em solução no criotubo. A viabilidade micelial após criopreservação a -75 °C, após 4 meses, foi efetiva para grãos de trigo ou ADB para todos os tratamentos, exceto para o controle de ADB que não teve sacarose no meio de cultivo ou no criotubo. O tempo de crescimento micelial para os tratamentos com viabilidade micelial ≥ 80% criopreservados a -75 °C foram de 1,2 a 5,3 dias e para os criopreservados a -20 °C foram de 2,5 a 5,9 dias, após quatro meses. Em geral conclui-se que a criopreservação a -75 °C proporciona maior percentual de viabilidade e menor tempo de recuperação micelial independente do meio de cultivo e da solução de imersão. A criopreservação a -20 °C, em geral é ineficaz. Na ausência de líquido de imersão o melhor meio de cultivo foi o de grãos de trigo para manter a viabilidade micelial do fungo criopreservado.
Palavras-chave
Basidiomiceto. Crioprotetor. Glicose. Sacarose. Criopreservação.
Title
Cryopreservation of basidiomycetes
Abstract
Some basidiomycetes have gastronomic, medicinal and biotechnological potential. The preservation is often made by continuous subculture where part of the fungus is successively transferred at risk of contamination by other microorganisms and dust mites. Furthermore, there is the possibility of occurring genetic damage with loss of biotechnological interest characteristics. Cryopreservation is an alternative of long-term preservation with a reduced risk of contamination and significant cellular damage. For cryopreservation of fungi, substances with potential chemocryoprotectant combined or not with mechanocryoprotectant agents are often used. The aim of this study was to evaluate the feasibility of basidiomycetes after cryopreservation at -75 °C and -20 °C previously cultivated in wheat grains or potato dextrose agar extract or malt extract agar with added glucose or sucrose in the cultivation medium and immersion solution. The work was divided into four parts. The first was the cryopreservation of basidiomycetes in wheat grains (GTD) immersed or not in a glucose solution at 4%, at 75 °C, for one year. The results showed mycelial viability ≥ 80% in all treatments differing only in the recovery time. The second part was the cryopreservation of Agaricus blazei with 3% or 6% glucose or 10% or 20% sucrose added in potato dextrose agar (ADB) or malt extract agar (AEM) and immersed in the cryoprotectant glucose at 4% or sucrose at 15% in the cryovial, cryopreserved at -75 °C and -20 °C for four months. The results showed mycelial viability ≥ 80% in all treatments cryopreserved at -75 °C, but when cryopreserved at -20 °C there was no mycelial viability. The third part was the cryopreservation of A. blazei in ADB or AEM with different concentrations of glucose or sucrose in the immerse solution, cryopreserved at -75 °C and at -20 °C, for four months. The results showed that for the cryopreservation at -75 °C, after 4 months using ADB culture medium, the mycelial viability was in the concentration range of the immersion liquid in cryovial from 15% to 27.5% of glucose and for AEM it was of 5%, 7.5%, 15%, 20%, 32.5% and 35%. For cryopreservation at -75 °C, after 4 months, using ADB culture medium, the mycelial viability was in the concentration range of the immerse liquid in the cryotube from 20% to 45% of sucrose and for AEM was of 5%, 20% and 22.5%. For cryopreservation at -20 °C after 4 months using ADB culture medium, the mycelium viability was in the concentration range soaking liquid in cryotube of 10% and 32.5% of glucose and for AEM it was of 32.5 %. For cryopreservation at -20 °C, after 4 months, using ADB culture medium, the mycelial viability was in the range of concentration liquid immersion cryotube of 32.5% sucrose and for AEM it was of 22.5%. The fourth part was the cryopreservation of A. blazei in GTD or ADB with 10% or 20% of sucrose in the culture medium, immersed or not, in solution of zero, 15%, 30% or 45% of sucrose in the immersion solution and cryopreserved at -75 °C and at -20 °C, for four months. The results showed that cryopreservation at -20 °C, after 4 months, was effective only for grains with 30% to 45% of sucrose in the immersion solution of cryotube without sugar in the culture medium, or 10% of sucrose in the medium cultivation and 45% of sucrose in solution in the cryotube, or 20% of sucrose in the culture medium, and 0%, 15% or 45% of sucrose in solution in the cryotube. For the ADB culture medium, it was effective for 10% of sucrose in the culture medium and 30% of sucrose solution in cryotube, or 20% cultivation medium and 15% or 45% of sucrose solution in cryotube. The mycelial viability after cryopreservation at -75 °C, after four months, was effective for wheat grains or ADB for all treatments, except for the control of ADB which had no sucrose in the culture medium or in cryotube. The mycelial growth time for the treatments with ≥ 80% cryopreserved at -75 °C was 1.2 to 5.3 days and for cryopreserved at -20 °C was 2.5 to 5.9 days after four months. In general it is concluded that cryopreservation at -75 °C gives a higher percentage of viability and shorter recovery time regardless of the mycelial culture medium and the immersion solution. Cryopreservation at -20 °C, generally is ineffective. In the absence of the immerse liquid, the best culture medium was the wheat grains to maintain the mycelial viability of the cryopreserved fungus.
Keywords
Basidiomycete. Cryoprotectant. Glucose. Sucrose. Cryopreservation.