Pesquisa
Cultivo de Lentinus crinitus em diferentes condições abióticas visando a produção de lacase
Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Renan Alberto Marim
Orientador: Juliana Silveira do Valle
Defendido em: 10/02/2017
Resumo
Neste trabalho investigou-se o cultivo sob influência de diferentes fatores abióticos sobre a produção de lacase, biomassa, capacidade de descoloração e atividade antioxidante de três linhagens de Lentinus crinitus (U9-1, U13-5 e U15-9). As linhagens foram cultivadas por 15 dias em diferentes pHs iniciais (5, 6 e 7) do meio, temperaturas (22, 25, 28 e 37 °C), luminosidade (escuro e luzes branca, azul, verde, vermelha e amarela). Após otimização do pH e da temperatura, a atividade de lacase e o crescimento micelial foram avaliados durante o cultivo sob diferentes condições de luminosidade em meio suplementado com o corante remazol azul brilhante R (RBBR) a 0,01%. A descoloração do corante foi acompanhada por 15 dias a cada 24 horas por espectrofotometria. A atividade antioxidante do micélio produzido foi determinada usando o método do 1,1-difenil-2-picrilidrazil (DPPH). A luz foi fornecida com diodos emissores de luz (LED) e a atividade de lacase foi determinada no 15º dia de cultivo pela oxidação do ABTS. Fatores como pH e temperatura de cultivo influenciaram não só o crescimento, como a produção de lacase pelo fungo. Os pH’s 6 e 7 e as temperaturas de 25 e 28°C aumentaram a atividade de lacase nas três linhagens. Observou-se também uma variabilidade entre as linhagens quanto a afinidade de lacase. A maior atividade de lacase (p≤0,05) foi registrada para a linhagem U13-5 em pH 7 (42187 U L-1) e para a linhagem U15-9 na temperatura de 28°C. A exposição à luz reduziu (p≤0,05) a atividade de lacase de todas as linhagens, as reduções mais significativas ocorreram sob luz azul para U9-1 (75%), U13-5 (59,5%) e U15-9 (49,5%). De forma contrária, a produção de biomassa de L. crinitus foi favorecida pela luz e as linhagens cresceram mais sob luz verde. O RBBR induziu a atividade de lacase, independentemente da luminosidade. A linhagem U9-1 teve o aumento mais significativo da atividade de lacase quando comparou-se a produção com o meio sem RBBR, variando de 92% (escuro) a 690% de aumento (luz azul). O mesmo ocorreu com a linhagem U13-5 que produziu mais lacase em meio com RBBR, 26% (luz verde) a 132% (luz azul). A suplementação com RBBR na linhagem U15-9 não afetou a produção de lacase no controle ou luz branca, mas favoreceu a atividade de lacase na luz amarela (aumento de 22%) e na luz azul (aumento de 86%). A presença do corante aumentou a produção de biomassa de L. crinitus somente em cultivo com luz. Lentinus crinitus foi capaz de descolorir o RBBR em todas as condições de luminosidade, contudo as diferentes linhagens responderam de forma distinta à luz. A capacidade de descoloração da linhagem U13-5 foi maior quando cultivada sob luz amarela (90%), U15-9 descoloriu mais sob luz verde e vermelha (75%), enquanto U9-1 descoloriu de maneira igual no escuro ou sob luz. A capacidade de sequestrar radicais livres DPPH de cada linhagem foi afetada de forma distinta pela luz. A linhagem U15-9 apresentou maior atividade antioxidante no escuro ou sob luz amarela (IC50 de 78 ± 21 mg mL-1). Já as linhagens U9-1 e U13-5 apresentaram maior atividade antioxidante quando cultivadas sob iluminação, particularmente sob luz branca. Esse é o primeiro relato da influência da luz sobre a atividade de lacase e biomassa micelial. A regulação fisiológica pela luz nessa espécie e revela interações complexas entre a luz e o metabolismo de L. crinitus o que pode afetar a produção de moléculas de interesse biotecnológico.
Palavras-chave
Basidiomicetos, fenoloxidase, luz visível, fotorreceptores, crescimento micelial
Title
Cultivation of Lentinus crinitus in different abyotetic conditions for lacase production
Abstract
This study has examined the influence of different abiotic factors on the production of laccase, biomass, discoloration capacity and antioxidant activity of three lines of Lentinus crinitus (U9-1, U13-5 and U15-9). The strains were cultured for 15 days at different initial pH (5, 6 and 7), temperatures (22, 25, 28 and 37 °C), luminosity (in the dark, and white, blue, green, red and yellow lights). After optimization of pH and temperature, laccase activity and mycelial growth were evaluated during culture under different light conditions in medium supplemented with 0.01% bright blue R-RMA (RBBR) dye. Dye discoloration was monitored for 15 days every 24 hours by spectrophotometry. The antioxidant activity of the mycelium produced was determined using the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) method. Light was supplied with light emitting diodes (LEDs) and laccase activity was determined on the 15th day of cultivation by ABTS oxidation. Factors such as pH and culture temperature influenced not only the growth, but also the production of laccase by the fungus. The pH 6 and 7 and temperatures of 25 and 28 ° C increased laccase activity in all three strains. A variability was also observed between the lineages for the affinity of laccase. The highest laccase activity (p≤0.05) was recorded for line U13-5 at pH 7 (42187 U L-1) and for line U15-9 at 28 °C. Light exposure reduced (p≤0,05) laccase activity of all strains, the most significant reductions occurred under blue light for U9-1 (75%), U13-5 (59.5%) and U15-9 (49.5%). Inversely, the biomass production of L. crinitus was favored by light and the strains grew more under green light. RBBR induced laccase activity regardless of brightness. The U9-1 strain had the most significant increase in laccase activity when the production was compared to the medium without RBBR, ranging from 92% (dark) to 690% increase (blue light). The same occurred with lineage U13-5 which produced more laccase in medium with RBBR, 26% (green light) to 132% (blue light). Supplementation with RBBR in the U15-9 strain did not affect laccase production in control or white light, but favored laccase activity in yellow light (22% increase) and blue light (86% increase). The presence of the dye increased the biomass production of L. crinitus only in culture with light. Lentinus crinitus was able to discolor the RBBR in all light conditions, however the different lineages responded differently to light. The discoloration capacity of the U13-5 lineage was higher when grown under yellow light (90%), U15-9 discolored further under green and red light (75%), while U9-1 discolored equally in the dark or under light. The ability to sequester DPPH free radicals from each lineage was affected differently by light. The U15-9 line presented higher antioxidant activity in the dark or under yellow light (IC50 of 78 ± 21 mg mL-1). However, the strains U9-1 and U13-5 showed higher antioxidant activity when grown under illumination, particularly under white light. This is the first report of the influence of light on laccase activity on the physiological regulation by light in this species and reveals complex interactions between light and metabolism of L. crinitus which may affect the production of molecules of biotechnological interest.
Keywords
Basidiomycetes, phenoloxidase, visible light, photoreceptors, mycelial growth