Pesquisa
“Efeito de diferentes comprimentos de onda de luz visível na produção de enzimas, compostos fenólicos e atividade antioxidante do micélio de Pleurotus spp.”
Doutorado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Nelma Lopes Araújo
Orientador: Juliana Silveira do Valle
Defendido em: 25/09/2020
Resumo
Pleurotus é um basidiomiceto que cresce em substratos ricos em matéria orgânica lignocelulósica conhecido por produzir enzimas de interesse industrial e compostos biologicamente ativos com diferentes propriedades. Fungos usam a luz como fonte de informação e podem sofrer alterações fisiológicas em resposta aos estímulos luminosos. O objetivo deste estudo foi cultivar Pleurotus spp. sob diferentes comprimentos de onda de luz para produção de micélio, enzimas e compostos bioativos. Inicialmente as linhagens P. ostreatus (U12-4, U16-21, U16-22), P. djamor (U16-25, U16-28), P. djamor var. roseus (16-20), P. citrinopileatus (U16-23) e P. eryngii (U16-30) foram cultivadas por 12 dias a 28 oC e na ausência de luz em três meios de cultivo diferentes para produção de enzimas e de biomassa micelial. Os meios de cultivo avaliados eram: meio extrato de malte (EM) 20 g L-1; meio definido (MD) contendo glicose 10 g L-1 e extrato de levedura 2 g L-1 e minerais; e meio líquido com bagaço de cana-de-açúcar (BC), igual ao MD, porém, a glicose foi substituída por BC (50 g L-1). O meio MD favoreceu a produção de celulase total e lacase enquanto o meio EM favoreceu a atividade de endoglicanase e xilanase. As maiores atividades no meio MD foram lacase de P. ostreatus U16-21 (20924 ± 46 U L-1) e celulase total de P. djamor U16-28 (394 ± 34 U L-1). No meio EM foram endoglicanase de P. ostreatus U16-22 (1606 ± 382 U L-1) e xilanase de P. citrinopileatus U16-23 (68535 ± 1590 U L-1). O meio EM favoreceu a produção de biomassa micelial sendo P. djamor U16-25 (4,5 ± 0,07 mg mL-1) o maior produtor. Usando a produção de lacase como parâmetro optou-se por cultivar Pleurotus spp. em meio MD nas etapas subsequentes. As linhagens foram então cultivadas em meio MD por 12 dias a 28 oC no escuro ou sob iluminação constante com diodos emissores de luz (LED) azul, verde ou vermelho e a biomassa micelial e atividades enzimáticas foram determinadas. A luz afetou a atividade enzimática e o crescimento com respostas distintas dependendo da linhagem ou espécie. A luz azul aumentou a atividade de celulase total, endoglicanase e xilanase, mas reduziu a atividade de lacase de P. ostreatus. Para P. citrinopileatus somente a atividade de lacase foi afetada pela luz azul, enquanto para P. djamor e P. eryngii a atividade enzimática aumentou ou diminuiu dependendo da linhagem. A luz verde aumentou a atividade das hidrolases e reduziu a atividade de lacase de P. ostreatus, mas as respostas das demais espécies à luz verde variaram. A luz vermelha aumentou, diminuiu, induziu ou inibiu a atividade enzimática de forma dependente da espécie e da linhagem. A produção de biomassa micelial, de modo geral, diminuiu ou não se alterou nos diferentes comprimentos de onda de luz. As maiores reduções ocorreram sob luz verde, seguida de luz azul. Os meios de cultivo com atividades de lacase oriundos do cultivo na luz foram utilizados na descoloração do corante antraquinona RBBR. A luz verde aumentou o poder de descoloração do RBBR pelo extrato de P. ostreatus, P. djamor e P. eryngii, enquanto a luz azul aumentou a descoloração somente de P. ostreatus. A luz vermelha reduziu a descoloração para todas as espécies avaliadas. Em seguida cultivamos algumas linhagens sob luz como descrito anteriormente visando a produção de biomassa que foi utilizada na caracterização das propriedades bioativas de Pleurotus spp. A biomassa micelial foi submetida extração com etanol:água (80:20, v v-1) a 50 °C por 45 minutos e o extrato foi utilizado para a quantificação de fenóis totais pelo método Folin-Ciocalteau e da atividade antioxidante pelos métodos DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil), FRAP (redução do ferro) e BCLA (co-oxidação do β-caroteno/ácido linoléico). As luzes azul > verde > vermelha aumentaram o teor de fenóis de P. eryngii e as luzes vermelha > verde aumentaram o teor de fenóis de P. djamor var. roseus enquanto a luz azul reduziu o teor de fenóis. A luz, independentemente do comprimento de onda, aumentou a atividade antioxidante de por sequestro de radicais de todas as espécies de Pleurotus analisadas, exceto a luz verde que reduziu a atividade antioxidante de P. ostreatus. A luz azul resultou no maior poder redutor de ferro de P. citrinopileatus, que foi duas vezes maior que o controle positivo Trolox. A luz verde promoveu o maior valor de FRAP para P. djamor e P. djamor var. roseus e a luz vermelha para P. eryngii. Somente a atividade antioxidante medida por BCLA de P. djamor var. roseus foi afetada pela luz, aumentando sob luz verde e diminuiu sob luz azul. O conhecimento sobre como a luz influencia Pleurotus spp. é valioso para o desenvolvimento de aplicações biotecnológicas e para a otimização de processos para produção de biomassa, enzimas e metabólitos de interesse.
Palavras-chave
Basidiomiceto, hidrolase, ligninase, luz visível, radical livre.
Title
Effect of different wavelengths of visible light on the production of enzymes, phenolic compounds, and antioxidant activity of the mycelium of pleurotus spp.
Abstract
Pleurotus is a basidiomycete that grows on substrates rich in lignocellulosic organic matter and produces enzymes of industrial interest and biologically active compounds with different properties. Fungi use light as a source of information and may undergo physiological changes in response to light stimuli. The objective of this study was to cultivate Pleurotus spp. under different light wavelengths to produce mycelial biomass, enzymes, and bioactive compounds. Initially, the strains P. ostreatus (U12-4, U16-21, U16-22), P. djamor (U16-25, U16-28), P. djamor var. roseus (16-20), P. citrinopileatus (U16-23) e P. eryngii (U16-30) were grown for 12 days at 28 oC and in the absence of light in three different culture media for the production of enzymes and mycelial biomass. The culture media evaluated were malt extract medium (ME) 20 g L-1; defined medium (DM) containing glucose 10 g L-1 and yeast extract 2 g L-1 and minerals; and a liquid medium with sugarcane bagasse (SB), equal to DM, however, glucose was replaced by SB (50 g L-1). The highest activities in DM medium were P. ostreatus U16-21 laccase (20924 ± 46 U L-1) and P. djamor U16-28 total cellulase (394 ± 34 U L-1). In the ME medium were P. ostreatus U16-22 endoglucanase (1606 ± 382 U L-1) and P. citrinopileatus U16-23 xylanase (68535 ± 1590 U L-1). The ME medium favored the production of mycelial biomass, being P. djamor U16-25 (4.5 ± 0.07 mg mL-1) the best producer. Using laccase production as a parameter, we chose to cultivate Pleurotus spp. in DM medium in the subsequent steps. The strains were then grown in DM medium for 12 days at 28 oC in the dark or under constant lighting with blue, green, or red light-emitting diodes (LED) and mycelial biomass and enzymatic activities were determined. Light affected the enzymatic activity and growth with different responses depending on the strain or species. Blue light increased total cellulase, endoglucanase, and xylanase activities, but reduced the laccase activity of P. ostreatus. For P. citrinopileatus only the laccase activity was affected by blue light, while for P. djamor and P. eryngii the enzymatic activities increased or decreased depending on the strain. The green light increased the hydrolases activities and reduced the laccase activity of P. ostreatus, but the responses of the other species to green light varied. The red light increased, decreased, induced or inhibited the enzymatic activity in a species and lineage dependent manner. The production of mycelial biomass, in general, decreased or did not change in the different wavelengths of light. The greatest reductions occurred under green light followed by blue light. The culture media with laccase activities from light cultivation were used to decolorize the anthraquinone dye RBBR. The green light increased the discoloration of RBBR by the extract of P. ostreatus, P. djamor, and P. eryngii, while the blue light increased the decolorization capacity only of P. ostreatus. The red light reduced the decolorization for all species evaluated. Then we cultivated some strains under light influence as previously described, aiming the production of mycelial biomass that was used in the characterization of the bioactive properties of Pleurotus spp. The mycelial biomass was subjected to extractions with ethanol: water (80:20, v v-1) at 50 °C for 45 min and the extract was used for the quantification of total phenols by the Folin-Ciocalteau method and the antioxidant activity by the methods DPPH (2,2-diphenyl-1-picrilhidrazil), FRAP (reduction of iron) and BCLA (co-oxidation of β-carotene/linoleic acid). The blue > green > red lights increased the phenol content of P. eryngii and the red > green lights increased the phenol content of P. djamor var. roseus while blue light reduced the phenol content. The light, regardless of the wavelength, increased the antioxidant activity of scavenging radicals of all Pleurotus species analyzed, except the green light that reduced the antioxidant activity of P. ostreatus. The blue light resulted in a greater iron-reducing power of P. citrinopileatus, twice that of the positive Trolox control. The green light promoted the highest FRAP value for P. djamor and P. djamor var. roseus and the red light for P. eryngii. Only the antioxidant activity measured by the BCLA method of P. djamor var. roseus was affected by light and increased under green light and decreased under blue light. Knowledge about how light influences Pleurotus spp. it is valuable for the development of biotechnological applications and for the optimization of processes for the production of biomass, enzymes, and metabolites of interest.
Keywords
Basidiomycete, free radical, hydrolase, ligninase, visible light.