Pesquisa
Hipertrofia de neurônios mientéricos nitrérgicos no jejuno de suínos com toxoplasmose
Mestrado em Ciência Animal com Ênfase em Produtos Bioativos
Autor: Leandro Odorizzi
Orientador: Eduardo José de Almeida Araújo
Defendido em: 25/06/2009
Resumo
Objetivou-se investigar as alterações causadas pela infecção por Toxoplasma gondii em neurônios do plexo mientérico do jejuno de suínos mediante a quantificação e morfometria. Para tanto, utilizaram-se dez suínos mestiços, resultantes do cruzamento das raças Pietrain e Wessex, com oitenta e oito dias de idade mantidos em baias coletivas no Hospital Veterinário da Universidade Paranaense – UNIPAR (Umuarama, Paraná, Brasil). Todos os animais receberam ração comercial balanceada e água ad libitum. Os animais foram divididos em dois grupos: Grupo controle (GC=5) e Grupo Experimental (GE=5). Os animais do GE receberam 5.000 oocistos esporulados da cepa M7741 de Toxoplasma gondii (Genótipo III) por via oral. Todos os animais foram submetidos a uma biópsia transabominal 30 dias após a inoculação. No momento da cirurgia, cada animal foi anestesiado para retirada de aproximadamente 10 cm de segmento jejunal, e colheita de sangue através da veia jugular. Por intermédio do método de aglutinação direta, o sangue coletado foi analisado para detecção da presença de IgG anti-T. gondi. Após retirada, os segmentos intestinais foram lavados com solução de cloreto de sódio a 0,9% heparinizada, na seqüência cinco centímetros foram lavados com tampão fosfato salino (PBS) 0,01M pH 7,4 e submetidos a técnica enzimohistoquímica da NADPH-diaforase e os outros cinco centímetros com tampão de Krebs pH 7,4 e foram submetidos a técnica enzimohistoquímica da NADH-diaforase. Em seguida, foram dissecados, com retirada da túnica mucosa e tela submucosa, restando preparados totais formados pela túnica muscular e serosa. Foi contado o número total de neurônios mientéricos de cada animal em 120 campos microscópicos (ampliados 400 vezes) distribuídos uniformemente por toda a circunferência intestinal. Além disso, foi mensurada a área do pericário, do núcleo e do citoplasma de 300 neurônios do plexo mientérico de cada animal. Parte dos segmentos lavados com PBS de cada suíno foi dissecada para formar amostras de túnica mucosa + tela submucosa, e túnica muscular + túnica serosa. Essas amostras foram avaliadas pela reação em cadeia e pela polimerase (PCR) visando detecção de DNA de T. gondii. Os dados foram submetidos ao teste de D’Agostinho para verificar o tipo de distribuição, sendo expressos como média ± desvios-padrão, os dados de distribuição normal e os demais como mediana e percentis 25 e 75 (P25 e P75). Para comparar os dados entre os grupos GC e GE, utilizou-se o teste t de Student para dados com distribuição normal e o teste de Mann-Whitney para os de distribuição livre. De acordo com o exame sorológico, todos os animais do GE tiveram resultado positivo para presença de anti-T. gondii, enquanto os do GC tiveram resultado negativo. Quanto aos resultados do experimento: Todos os animais do GE tiveram diarréia constante a partir do 13° dia após a inoculação, fato não observado em nenhum animal do GC. Foi observado na análise por PCR, a presença do parasito em um animal do GE, especificamente no estrato formado pela mucosa + submucosa. Todavia, não foi observada alteração na densidade populacional dos neurônios mientéricos NADH-diaforase positivos (NADHd-p) e NADPH-diaforase positivos (NADPHd-p). Observou-se hipertrofia nos neurônios mientéricos NADPHd-p e aumento do núcleo dos neurônios NADHd-p. Quanto à freqüência de neurônios divididos em classes de acordo com a área do pericário, observa-se que a maior parte dos neurônios NADPHd-p se concentrava num espectro de até 300, sendo encontrado neurônios até com mais de 1000 m2. Já nos neurônios NADHd-p, observou-se que o número dessas células concentrou-se em até 300 m2 e depois decresceu, apresentando um número menor de células acima de 700 m2. Conclui-se que o genótipo III de T. gondii utilizado neste estudo não causou morte neuronal, contudo observou-se hipertrofia dos neurônios mientéricos NADPHd-p e redução do núcleo dos neurônios mientéricos NADHd-p no jejuno de suínos.
Palavras-chave
Sistema Nervoso Entérico; Sus scrofa; Infecção; Parasita.
Title
Hypertrophy of nitrergic myenteric neurons of swines with toxoplasmosis.
Abstract
This study aimed at assessing the changes caused by the infection with Toxoplasma gondii in myenteric plexus neurons in swine jejunum were assessed through quantification and morphometry. Ten 88-day-old crossbred swines (Pietran and Wessex) were maintained in feedlots in the Veterinary Hospital of Universidade Paranaense – UNIPAR (Umuarama, Paraná, Brazil). All animals were fed a balanced diet and water ad libitum and were assigned assigned into two groups: Control Group (CG = 5) and Experimental Group (EG = 5). Animals from the EG orally received 5,000 oocysts from the genotype III Toxoplasma gondii M7741 strain. All animals were submitted to transabdominal biopsy 30 days after inoculation. At the moment of the surgery, each animal was anesthesized for the removal of approximately 10 cm of the jejunal segment and blood collection through the jugular vein. Blood was collected and analyzed for the detection of anti-T. gondii IgG presence through direct agglutination test. After removal, the intestinal segments were washed in 0.9% heparined NaCl solution – 5 cm were washed in 0.01M PBS (pH 7.4) and submitted to NADPH-diaphorase technique and the other 5 cm were washed in Krebs bupher (pH 7.4) and submitted to NADPH-diaphorase technique. They were dissected; mucosa and submucosa were removed, leaving the whole mount formed by the external muscle and serosa. The amount of myenteric neurons in 120 microscopic fields (magnified 400X) uniformly distributed around the intestinal circumpherence of each animal was counted. The area of perikarion, nucleus and cytoplasm of 300 myenteric plexus neurons of each animal was measured. Part of the segments washed in PBS from each swine was dissected for samples of mucosa + submucosa and external muscle + serosa. These samples were assessed by polymerase chain reaction (PCR) for the detection of T. gondii DNA. Data were submitted to D’agostino test in order to verify the type of distribution – mean±standard deviation was used for normal distributional data and the others were expressed in median and percentiles 25 and 75 (P25 e P75). In order to compare data between CG and EG, Student’s t-test was used for normal distributional data and Mann-Whitney test for free distribution data. According to the serologic exam, all animals from the EG presented positive result for the presence of anti-T. gondii whereas the CG animals presented negative result. With respect to results of the experiment: all animals from the EG presented recurring diarrhea 13 days after inoculation – fact not noticed in any animal from the CG. The presence of the parasite in one animal from the EG, specifically in the extract from mucosa + submucosa, was noticed in the PCR analysis. No change for the population density of myenteric neurons NADH-diaphorase positive (NADHd-p) and NADPH-diaphorase positive (NADPHd-p) was noticed. Hypertrophy of NADPHd-p myenteric neurons and increase the nucleus of NADHd-p neurons were noticed. Concerning the frequency of neurons assigned into classes according to perikarion area, it is noticed that most of the NADPHd-p neurons was concentrated within a spectrum up to 300 m2 – neurons with up to 1000 m2 were found. NADHd-p neurons concentrated in up to 300m2 and then decreased presenting a lower amount of less larger than 700 m2. It was concluded in this study that genotype III T. gondii did not provoke neuronal death; however, hypertrophy of NADPHd-p myenteric neurons and the reduction of the nucleus of NADHd-p myenteric neurons of swine jejunum were noticed.
Keywords
Enteric Nervous System; Sus scrofa; Infection; Parasite.