Pesquisa
Identificação de genes relacionados à atividade lignocelulolítica em linhagens de fungos basidiomicetos
Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Aline Franciele Navarro Volpini
Orientador: Silvia Graciele Hülse de Souza
Defendido em: 26/03/2013
Resumo
A biomassa lignocelulósica é abundante, apresenta baixo custo e tem sido vista como uma fonte promissora para a agroindústria, os materiais lignocelulósicos, são os mais abundantes complexos orgânicos de carbono na forma de biomassa, sendo esta composta por três constituintes principais: celulose, hemicelulose e lignina. Os organismos predominantemente responsáveis pela degradação da lignocelulose são os fungos, e os degradadores mais rápidos neste grupo são os fungos basidiomicetos. A hidrólise dos materiais lignocelulósicos ocorre através de grupos de enzimas que atuam de forma cooperada, causando a hidrólise da celulose até glicose. O sistema de regulação dos genes que codificam enzimas celulolíticas é controlada no nível transcricional, onde na presença de D-glicose a transcrição é reprimida, enquanto que na ausência desse açúcar e presença de certos oligossacarídeos ou dissacarídeos a transcrição é fortemente induzida. A expressão de genes ligninolíticos é induzida pela restrição de alguns nutrientes. A identificação em fungos basidiomicetos de enzimas, e seus respectivos genes codificadores, envolvidas nos processos de degradação de fibras lignocelulósicas é de grande importância para o desenvolvimento de novas estratégias e aplicações biotecnológicas nos processos industriais que utilizam resíduos e fibras vegetais para as mais diversas aplicações. Desta forma, este trabalho teve como objetivos identificar os genes relacionados à atividade lignocelulolítica das linhagens de fungos basidiomicetos da micoteca do Laboratório de Biologia Molecular da UNIPAR. Para a avaliação da atividade enzimática, os isolados foram mantidos a 25 ºC em meio BDA a 3.9%. A caracterização dos fungos basidiomicetos produtores de celulase foi realizada através de método qualitativo em meio CMC. A caracterização dos isolados de fungos basidiomicetos produtores de enzimas ligninolíticas (lacase) foi realizada através de método qualitativo após crescimento em meio de cultivo AEM e ABD contendo guaiacol. A identificação dos isolados quanto à presença de genes que codificam enzimas lignocelulolíticas foi realizada com base na amplificação por PCR utilizando primers sintetizados com base em similaridade de sequências gênicas depositadas em banco de dados, seguido das etapas de sequenciamento e análise de similaridade, comparando-se com sequências de genes depositadas no banco de dados GenBanK (NCBI). Os resultados obtidos possibilitaram a identificação de linhagens produtoras de lacases, celulases e ambas as enzimas. Foi possível obter o sequenciamento e a identificação de genes codificadores de lacases na maioria das linhagens analisadas e celulases em duas das linhagens analisadas, seguido da identificação dos domínios conservados de proteínas a partir das sequências gênicas. Portanto, estes resultados irão possibilitar o melhor aproveitamento do potencial genético destas linhagens para a utilização biotecnológica na degradação de fibras vegetais como as existentes nos resíduos agroindustriais.
Palavras-chave
*Pleurotus Ostreatus, Agaricus blazei, Lentinula edodes, Schizophyllum commune*, basidiomicota.
Title
Identification of genes related to the lignocellulolytic activity in basidiomicetous fungi strains
Abstract
Lignocellulosic biomass is plentiful, has low cost and has been seen as a promising source for agribusiness, lignocellulolytic materials are the most abundant organic complexes of carbon in the plant biomass form that is composed by three principal constituents: cellulose, hemicellulose and lignin. The fungi are the organisms predominantly responsible for the lignocellulose degradation, and the most fast degradators are the basidiomycetous fungi. The hydrolysis of lignocellulosic materials occurred through groups of enzymes that act in cooperation, resulting in the hydrolyses of cellulose to glucose. The regulation system of the genes that codify the cellulolytic enzymes are controlled at the transcriptional level. The expression of the ligninolytic genes are induced by the restriction of some nutrients. The identification and characterization in the basidiomycetous fungi, of enzymes and their respective codifying genes, involved in the degradation of lignocellulosic fibers, are of large importance to the development of new strategies and biotechnological applications in the industrial processes that uses vegetal fibers and waste for the most different applications. Therefore, this work had as objectives the characterization of the lignocellulolytic enzymes and the identification of codifying genes of these enzymes from basidiomycetous fungi strains from the culture collection of the Molecular Biology Laboratory of UNIPAR. To the enzymatic activity evaluation, the isolates were maintained at 25oC in 3.9% PDA medium. The characterization of the cellulase producing basidiomycetous fungi strains were done through the qualitative method in CMC medium. The characterization of basidiomycetous fungi strains producing lignolytic enzymes (laccases) were done trough the qualitative method after growth in AME culture medium added with guaiacol. The characterization of the isolates for the presence of genes that codify to lignocellulolytic enzymes was done by the PCR amplification using primers synthesized based on the similarities with nucleotide sequences deposited in nucleotide data bank, and after by the sequencing and comparative analysis by similarities to gene sequences deposited on the GenBank (NCBI). The results obtained enable the identification of strains producers of laccase, cellulose, and both enzymes. It was possible to obtain the nucleotide sequence and identification of laccase and cellulase genes in the most of strains analyzed. Therefore, these results will enable the better use of the genetic potential of these strains for the biotechnological use in the vegetal fiber degradation as the existing in agro industrial wastes.
Keywords
*Pleurotus Ostreatus, Agaricus blazei, Lentinula edodes, Schizophyllum commune*, basidiomycota.