Pesquisa
Identificação química e atividade antimicrobiana dos óleos essenciais e extratos brutos de folhas, botões florais e ramos de Tetradenia riparia.
Doutorado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Juliana Scanavacca
Orientador: Zilda Cristiani Gazim
Defendido em: 17/02/2022
Resumo
Tetradenia riparia (Hochst.) Codd pertence à família Lamiaceae é originária na África do Sul, popularmente conhecida como mirra. O óleo essencial das folhas de T. riparia apresenta ampla atividade biológica como antimicrobiana, inseticida, tripanomicida, antimalárica e antioxidante. A deterioração de alimentos é um problema amplamente negligenciado e o uso de fontes naturais de antimicrobianos tem sido uma busca contínua para estender a vida útil dos alimentos. Diante disso, este trabalho teve como objetivo avaliar a identificação química e atividade antimicrobiana dos óleos essenciais e dos extratos brutos das folhas, botões florais e ramos de Tetradenia riparia. O trabalho foi dividido em quatro capítulos. No capítulo I, as folhas coletadas na primavera foram secas, o óleo essencial extraído por hidrodestilação, e os compostos químicos identificados por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa. Atividade antimicrobiana foi avaliada por microdiluição modificada contra sete bactérias e oito fungos. Os principais compostos identificados foram os sesquiterpenos oxigenados (43,6%): 14-hidroxi-9-epi- (E) -cariofileno (20,8%) e τ-cadinol (18,4%); seguido de diterpenos oxigenados (24,6%): 6-7-dehidroroileanona (12.6%) e 9β, 13β-epoxi-7-abieteno (10.6%); hidrocarbonetos sesquiterpênicos (17,1%), e monoterpenos oxigenados (7,4%): fenchona (5,6%). O óleo essencial das folhas possui ampla atividade antibacteriana e antifúngica, principalmente contra A. versicolor, B. cereus, S. aureus, e L. monocytogenes com atividade antimicrobiana maior (0,05 mg mL-1) que os controles positivos, evidenciando o potencial do óleo essencial de folhas de T. riparia para o desenvolvimento de aplicações para controle de microrganismos. No capítulo II, amostras de T. riparia (folhas, botões e ramos) foram coletadas no inverno e o óleo essencial foi obtido por hidrodestilação. Para obtenção do extrato bruto, as folhas, botões florais e ramos secos foram pulverizados e submetidos ao processo de maceração dinâmica utilizando álcool etílico 70% v v-1. A análise química do óleo essencial foi realizada por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas, e a identificação química do extrato bruto por Cromatografia Liquida de Ultra Eficiência. A atividade antifúngica contra Rhizopus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceaus, Penicillium verrucosum e Fusarium graminearum foi realizada por microdiluição em caldo e o ensaio antimicotoxigênico foi realizado com A. ochraceaus e P. verrucosum. A micotoxina ocratoxina A foi extraída com partição com clorofórmio e quantificada em Cromatografia Liquida de Alta Eficiência com detector de Fluorescência. O rendimento dos óleos foi de 0,29% para folhas, 0,34% para ramos e de 0,38% para botões florais, e os compostos majoritários foram fenchona, β-cariofileno, α-cadinol, 14-hidroxi-9-epi-cariofileno, 9β,13β-epoxi-7-abieteno, α-cadinol e 6-7- dehidroroileanona. Os principais compostos químicos identificados, no extrato bruto, foram terpenos, antocianinas, flavonóides, tanino e ácidos fenólicos. A concentração inibitória mínima (CIM) dos óleos de folhas, botões florais e ramos para as cepas testadas variou entre 0,87 mg mL-1 e 33,3 mg mL-1, enquanto a concentração fungicida mínima (CFM) variou entre 6,94 mg mL-1 e 33,3 mg mL-1. A CIM e a CFM dos controles cetoconazol, tebuconazol, sorbato e nitrito variou de 0,05 a 33,3 mg mL-1. O óleo e o extrato bruto de folhas, ramo e botões florais apresentaram aproximadamente 100% de inibição da produção de ocratoxina A para P. verrucosum. Portanto, tanto o óleo quanto o extrato de T. riparia possuem potencial para utilização como antimicotoxigênico. No capítulo III foram utilizados os mesmos óleos e extratos de folhas, botões florais e ramos do capítulo II para avaliar a atividade antibacteriana. A atividade foi realizada pelo método de microdiluição em placas, as cepas utilizadas na atividade antibacteriana foram: Listeria monocytogenes, S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella entérica serovar typhi, E. coli, Shigella flexineri, Bacillus cereus, Salmonella thiphimurium, e Stapylococcus aureus. Tanto o óleo essencial como os extratos de folhas, botões florais e ramos demonstraram atividade antimicrobiana com CIM entre ˂ 0,05 mg mL-1 a 33,3 mg mL-1. Os resultados in vitro permitem concluir que os óleos e extrato bruto de folhas, botões florais e ramos de T. riparia apresentam ação antibacteriana possuindo potencial para alternativas terapêuticas antimicrobianas, assim como novos conservantes para uso na indústria de alimentos. No capítulo IV o objetivo foi identificar quimicamente e avaliar o efeito antimicrobiano de óleos essenciais de folhas e ramos de Tetradenia riparia cultivadas no verão sobre bactérias e fungos contaminantes de alimentos. O óleo essencial foi obtido por hidrodestilação e a análise química foi realizada por Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas. A atividade antimicrobiana foi realizada pelo método de microdiluição em caldo. As cepas utilizadas na atividade antimicrobiana foram: Listeria monocytogenes, S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella entérica serovar Typhi, Escherichia coli, Shigella flexineri, Bacillus cereus, Salmonella thiphimurium e Stapylococcus aureus. Para os bioensaios antifúngicos foram utilizados os fungos: Rhizopus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceaus, Penicillium verrucosum. Na composição química, os compostos majoritários foram fenchona, β-cariofileno, α-cadinol, 14-hidroxi-9-epi-cariofileno, 9β,13β-epoxi-7-abieteno, α-cadinol e 6-7- dehidroroileanona. O óleo essencial de folhas e ramos de T. riparia apresentaram atividade antibacteriana. Destaca-se a atividade para S. aureus ATCC 14458 com CIM de ˂0,05 mg mL-1 para óleo de folhas e ramos; de L. monocytogenes* com CIM de ˂0,05 mg mL-1 de óleo de ramos e de 0,05 mg mL-1 para óleo de folhas; e B. cereus com CIM de 0,05 mg mL-1 para óleo de folhas. A atividade antifúngica para óleo de folhas e ramos coletados no verão foi considerada fraca com MIC acima de 1,50 mg mL-1 para as espécies de fungos testados. O óleo essencial de folhas e ramos de T. riparia apresentaram atividade antimicrobiana, destacam-se as antibacterianas que mais eficazes do que as atividades antifúngicas. A atividade antibacteriana foi superior à dos compostos sintéticos torna-se uma alternativa potencial como bioconservantes, porém novas pesquisas devem ser conduzidas para confirmar e definir a melhor forma de aplicação destes óleos essenciais em alimentos. De fato, os óleos essenciais estão a caminho de revolucionar a conservação de alimentos, os resultados são promissores, contribuindo com o desenvolvimento de novos aditivos químicos e para produção de alimentos mais seguros.
Palavras-chave
antibacteriano, antifúngico, antimicotoxigênico,14-hidroxi-9-epi-cariofileno, Lamiaceae, falsa mirra.
Title
Antimicrobial activity and chemical identification of essential oils and crude extracts from Tetradenia riparia leaves, flower buds and stems
Abstract
Tetradenia riparia (Hochst.) Codd belongs to the Lamiaceae family and is native to South Africa, popularly known as myrrh. The essential oil from the leaves of T. riparia have broad biological activity as an antimicrobial, insecticidal, trypanocidal, antimalarial and antioxidant. Food spoilage is a largely neglected problem and the use of natural sources of antimicrobials has been an ongoing quest to extend the shelf life of foods. Therefore, this study aimed to evaluate the chemical identification and antimicrobial activity of essential oils and crude extracts from leaves, flower buds and branches of Tetradenia riparia. The work was divided into four chapters. In chapter I, the leaves collected in spring were dried, the essential oil extracted by hydrodistillation, and the chemical compounds identified by Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry. Antimicrobial activity was evaluated by modified microdilution against seven bacteria and eight fungi. The main compounds identified were the oxygenated sesquiterpenes (43.6%): 14-hydroxy-9-epi-(E) -caryophyllene (20.8%) and τ- cadinol (18.4%); followed by oxygenated diterpenes (24.6%): 6-7-dehydroroyleanone (12.6%) and 9β, 13β-epoxy-7-abietene (10.6%); sesquiterpene hydrocarbons (17.1%), and oxygenated monoterpenes (7.4%): fenchone (5.6%). The essential oil of the leaves has broad antibacterial and antifungal activity, mainly against A. versicolor, B. cereus, S. aureus, and L. monocytogenes with higher antimicrobial activity (0.05 mg mL -1) than the positive controls, showing the potential of the essential oil from T. riparia leaves for the development of applications to control microorganisms. In chapter II, samples of T. riparia (leaves, buds and branches) were collected in winter and the essential oil was obtained by hydrodistillation. To obtain the crude extract, the leaves, flower buds and dried branches were pulverized and submitted to the dynamic maceration process using 70% ethyl alcohol vv -1. The chemical analysis of the essential oil was performed by gas chromatography coupled to mass spectrometry, and the chemical identification of the crude extract by Ultra Efficiency Liquid Chromatography. Antifungal activity against Rhizopus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceaus , Penicillium verrucosum and Fusarium graminearum was performed by broth microdilution and the antimycotoxigenic assay was performed with A. ochraceaus and P. verrucosum. The mycotoxin ochratoxin A was partitioned with chloroform and quantified in High Performance Liquid Chromatography coupled with Fluorescence Detector. The oil yield was 0.29% for leaves, 0.34% for branches and 0.38% for flower buds, and the major compounds were fenchone, β-caryophyllene, α-cadinol, 14-hydroxy-9-epi-caryophyllene, 9β,13β-epoxy-7-abietene, α- cadinol and 6-7- dehydroroyleanone. The main chemical compounds identified in the crude extract were terpenes, anthocyanins, flavonoids, tannins and phenolic acids. The minimum inhibitory concentration (MIC) of oils from leaves, flower buds and branches for the tested strains ranged from 0.87 mg mL -1 and 33.3 mg mL -1, while the minimum fungicide concentration (MFC) varied between 6.94 mg mL -1 and 33.3 mg mL -1. The MIC and MFC of ketoconazole, tebuconazole, sorbate and nitrite controls ranged from 0.05 to 33.3 mg mL -1. The oil and crude extract of leaves, branches and flower buds showed approximately 100% inhibition of ochratoxin A production for P. verrucosum. Therefore, both the oil and the extract of T. riparia have potential for use as an antimycotoxigenic. In chapter III, the same oils and extracts of leaves, flower buds and branches of chapter II were used to evaluate the antibacterial activity. The activity was carried out by the microdilution method in plates, the strains used in the antibacterial activity were: Listeria monocytogenes, S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica serovar Typhi, E. coli, Shigella flexineri, Bacillus cereus, Salmonella thiphimurium, and Stapylococcus aureus. Both the essential oil and extracts from leaves, flower buds and branches showed antimicrobial activity with MIC between ˂ 0.05 mg mL -1 to 33.3 mg mL -1. The in vitro results allow us to conclude that the oils and crude extracts from leaves, flower buds and branches of T. riparia present antibacterial action with potential for antimicrobial therapeutic alternatives, as well as new preservatives for use in the food industry. In chapter IV the objective was to chemically identify and evaluate the antimicrobial effect of essential oils from leaves and branches of Tetradenia riparia grown in summer on bacteria and fungi contaminating food. Essential oil was obtained by hydrodistillation. Chemical analysis of the essential oil was performed by Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry. Antimicrobial activity was performed by the broth microdilution method. The strains used in the antimicrobial activity were: Listeria monocytogenes, S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica serovar Typhi, Escherichia coli, Shigella flexineri, Bacillus cereus, Salmonella thiphimurium and Stapylococcus aureus. For the antifungal bioassays, the following fungi were used: Rhizopus oryzae, Aspergillus flavus, aspergillus ochraceaus, Penicillium verrucosum. In chemical composition, the major compounds were fenchone, β - caryophyllene, α - cadinol, 14-hydroxy-9-epi-caryophyllene, 9β,13β-epoxy-7-abietene, α- cadinol and 6-7- dehydroroyleanone. The essential oil of leaves and branches of T. riparia showed antibacterial activity. The activity for S. aureus ATCC 14458 with MIC of ˂0.05 mg mL -1 for leaves and branches oils stands out; of L. monocytogenes with MIC of ˂0.05 mg mL -1 for essential oils of branches and of 0.05 mg mL -1 for essential oils of leaves; and B. cereus with MIC of 0.05 mg mL -1 for leaf essential oil. The antifungal activity for essential oils of leaves and branches collected in the summer was considered weak with MIC above 1.50 mg mL -1 for the tested fungal species. The essential oil of leaves and branches of T. riparia showed antimicrobial activity, the antibacterial ones being more effective than the antifungal activities. The antibacterial activity was superior to that of synthetic compounds, making it a potential alternative as biopreservatives, but further research should be conducted to confirm and define the best way to apply these essential oils in foods. In fact, essential oils are on the way to revolutionizing food preservation, the results are promising, contributing to the development of new chemical additives and the production of safer food.
Keywords
antibacterial, antifungal, antimycotoxigenic, 14-hydroxy-9-epi-caryophyllene, Lamiaceae, false myrrh.