Pesquisa
Influência da luz e do meio de cultivo no micélio de Lentinus crinitus: determinação de atividades biológicas, purificação e caracterização molecular da lacase e aplicação na descoloração de corantes
Doutorado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Marisangela Isabel W. Halabura
Orientador: Juliana Silveira do Valle
Defendido em: 14/12/2023
Resumo
Lentinus crinitus é um fungo lignocelulolítico de importância na cultura de povos originários da Amazônia. Fungos utilizam a luz como fonte de informação sobre o ambiente e, combinada à composição do meio de cultivo, são fatores que afetam a produção de enzimas e o crescimento constituindo aspectos de interesse biotecnológico. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da luz e composição do meio de cultivo na produção de lacase e biomassa micelial de L. crinitus, purificar e caracterizar molecularmente a lacase, aplicar na descoloração de corantes e avaliar as atividades biológicas do fungo. Neste estudo avaliou-se o crescimento de L. crinitus em meio líquido contendo diferentes fontes de carbono (glicose, sacarose, carboximetilcelulose, celulose microcristalina, vinhaça e melaço de cana-de-açúcar) e de nitrogênio (extrato de levedura, sulfato de amônio, e ureia e sem nitrogênio) por 15 ou 21 dias a 28°C no escuro, ou sob luz azul (455-475 nm), verde (515-530 nm), ou vermelha (620-630 nm). A lacase produzida em meio com sacarose e sulfato de amônio foi purificada por filtração e cromatografia, sua massa molecular, parâmetros cinéticos e perfil da estrutura secundária por espectroscopia de dicroísmo circular foram determinados. O pH e a temperatura ideais também foram determinadas e a enzima foi usada na descoloração de corantes. Foram determinados o teor de fenóis, atividades antioxidantes, antibacteriana e fator de proteção solar do micélio do cultivo com melaço de cana-de-açúcar e extrato de levedura. A luz afetou a atividade de lacase, sendo a maior atividade no cultivo escuro em meio com sacarose e sulfato de amônio (29484 U L-1) e 0,17 mg mL-1 de biomassa, e meio com glicose e extrato de levedura (25564 U L-1) com biomassa de 4,24 mg mL-1. A lacase de L. crinitus possui quatro átomos de cobre por unidade biológica, sua estrutura secundária é enovelada em folha beta e a massa molecular é de ~55,1 kDa. Possui maior afinidade pelo substrato 2,2-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) (ABTS), seu pH ideal é 5,0 e a temperatura ideal 55 °C. O extrato enzimático bruto foi eficiente na descoloração dos corantes azul reativo 220 (A220) e remazol azul brilhante R (RBBR) com 95% e 88% de descoloração respectivamente, enquanto para o corante verde malaquita (VM) a descoloração foi de apenas 8%. A lacase pré purificada (2500 U L-1) descoloriu 57% do A220 e 40% do RBBR com 75000 U L-1, ambos em 6 h de reação. A lacase pré purificada foi mais eficiente na descoloração do VM atingindo 68% de descoloração em 72 h. As luzes azul, verde e vermelha aumentaram o teor de fenóis totais no extrato etílico da biomassa micelial, o maior teor de fenóis foi da biomassa micelial cultivada na luz verde (874,81 µg EAG 100 mg-1). A atividade de sequestro do radical DPPH foi maior com extrato metílico da biomassa micelial do cultivo sob a luz verde e azul (IC50 = 50 mg mL-1) enquanto a atividade de redução do ferro foi maior com extrato etílico no cultivo sob a luz verde (27,6 µM Fe2+ g-1). As diferentes condições de iluminação aumentam o fator de proteção solar dos extratos etílicos da biomassa micelial de L. crinitus. No extrato da biomassa cultivada na luz vermelha o fator de proteção foi de 30+ quando avaliado na concentração de 25 mg mL-1. As atividades antimicrobianas do extrato etílico do micélio de L. crinitus apresentaram MIC entre 1,8 e 50 mg mL-1, atividades equivalentes ou superiores aos controles nitrito de sódio e sorbato de potássio (MIC = 3,6 a 50 mg mL-1) para praticamente todas as bactérias testadas. Os resultados demonstram que tanto a luz como as modificações do meio de cultivo representam estratégias simples que podem ser aplicadas no melhoramento da atividade biológica e produção de enzimas de L. crinitus.
Palavras-chave
Basidiomiceto. Caracterização molecular. Lacase. Descoloração de corante têxtil. Fator de proteção solar.
Title
Influence of light and culture medium on Lentinus crinitus mycelium: determination of biological activities, purification and molecular characterization of laccase and application in dye decolorization
Abstract
Lentinus crinitus is a lignocellulolytic fungus of importance in the culture of Amazonian originary peoples. Fungi use light as a source of information about the environment and, combined with the composition of the cultivation medium, these are factors that affect the production of enzymes and growth, constituting aspects of biotechnological interest. The aim of this study was to evaluate the effects of light and composition of the cultivation medium on the production of laccase and mycelial biomass of L. crinitus, purify and molecularly characterize the laccase, apply it to the decolorization of dyes and evaluate the biological activities of the fungus. In this study, the growth of L. crinitus was evaluated in a liquid medium containing different sources of carbon (glucose, sucrose, carboxymethyl cellulose, microcrystalline cellulose, vinasse, and sugar cane molasses) and nitrogen (yeast extract, ammonium sulfate, and urea and no nitrogen) for 15 or 21 days at 28°C in the dark, or under blue (455-475 nm), green (515-530 nm), or red (620-630 nm) light. The laccase produced in a medium with sucrose and ammonium sulfate was purified by filtration and chromatography, its molecular mass and kinetic constants were determined, and the secondary structure was determined by circular dichroism spectroscopy. The ideal pH and temperature were determined, and the enzyme was used to decolorize dyes. The phenol content, antioxidant, antibacterial activities, and sun protection factor of the mycelium from the cultivation with sugar cane molasses and yeast extract were determined. Light affected laccase activity, with the greatest activity being in dark cultivation in medium with sucrose and ammonium sulfate (29484 U L-1) and 0.17 mg mL-1 of biomass and medium with glucose and yeast extract (25564 U L-1) with a biomass of 4.24 mg mL-1. Laccase from L. crinitus has four copper atoms per biological unit, its secondary structure is folded into a beta-sheet, and the molecular mass is ~55.1 kDa. It has a greater affinity for the substrate 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS). Its ideal pH is 5.0, and the ideal temperature is 55 °C. The crude enzymatic extract efficiently decolorized the reactive blue 220 (A220) dyes and remazol brilliant blue R (RBBR) with 95% and 88% decolorization, respectively. In contrast, for the dye malachite green (MG), the decolorization was only 8%. The pre-purified laccase (2500 U L-1) decolorized 57% of the A220 and 40% of the RBBR with 75000 U L-1 in 6 h of reaction. The pre-purified laccase was more efficient in discoloring MG, reaching 68% discoloration in 72 h. Blue, green, and red lights increased the total phenol content in the ethyl extract of mycelial biomass. The highest phenol content was in mycelial biomass cultivated in green light (874.81 µg EAG 100 mg-1). DPPH radical scavenging activity was greater with methyl extract of mycelial biomass from cultivation under green and blue light (IC50 = 50 mg mL-1), while iron reduction activity was greater with ethyl extract from cultivation under green light (27.6 µM Fe2+ g-1). Different lighting conditions increase the sun protection factor of ethyl extracts from L. crinitus mycelial biomass. In the biomass extract grown in red light, the protection factor was 30+ when evaluated at a concentration of 25 mg mL-1. The antimicrobial activities of the ethyl extract of L. crinitus mycelium showed MIC between 1.8 and 50 mg mL-1, activities equivalent or superior to the controls sodium nitrite and potassium sorbate (MIC = 3.6 to 50 mg mL-1) for virtually all bacteria tested. The results demonstrate that both light and modifications of the cultivation medium represent simple strategies that can be applied to improve the biological activity and enzyme production of L. crinitus.
Keywords
Basidiomycete. Molecular characterization. Laccase. Decolorization of textile dyes. Solar protection factor.