Pesquisa
Influência do cocultivo no crescimento micelial, produção de lacase e capacidade de descoloração de quatro espécies de basidiomicetos
Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Katielle Vieira Avelino
Orientador: Juliana Silveira do Valle
Defendido em: 16/02/2018
Resumo
Avaliou-se o efeito do cocultivo dos basidiomicetos Lentinus crinitus U9-1, Pycnoporus sanguineus U13-4, Pleurotus ostreatus U2-11 e Trametes polyzona U16-5 sobre a oxidação do guaiacol em meio sólido, produção de lacase, crescimento micelial e descoloração de corantes sintéticos in vitro e durante o crescimento dos fungos. O meio de cultivo ágar-extrato-de-malte - AEM (2%) foi suplementado com guaiacol para estimar a atividade de ligninases e verificar possíveis interações dos micélios em cocultivo. Para o cocultivo submerso os fungos foram cultivados isoladamente e em cocultivo (aos pares) em meio extrato de malte sem e com a suplementação dos corantes: RBBR, A220 ou VM (0,01%), mantidos a 28°C, no escuro por 15 dias. A descoloração foi acompanhada a cada 24 horas, e ao final do cultivo a produção de lacase foi determinada pela oxidação do ABTS e o micélio foi usado na determinação da biomassa seca por método termogravimétrico. Os extratos enzimáticos obtidos ao final do cultivo (sem suplementação) foram utilizados para a descoloração de soluções de corante de diferentes classes químicas (0,01%) em tampão acetato de sódio pH 5. A descoloração foi acompanhada por espectrofotometria por uma hora a cada vinte minutos e a cada 24 horas por 72 horas. Todos os fungos em cocultura foram capazes de oxidar o guaiacol e crescer em conjunto, mas a maioria das combinações apresentou intensidade da cor inferior ou semelhante à observada em monocultura. O cocultivo influenciou a produção de lacase e biomassa no meio sem a suplementação do corante. Para a combinação Trametes-Pleurotus a produção de lacase foi (34280 U L-1) 14% maior (p≤0,05) que T. polyzona (30000 U L-1) e 84% maior (p≤0,05) que P. ostreatus (18595 U L-1) quando isolados, e para esta mesma combinação a produção de biomassa foi 17% maior (p≤0,05) que ambos os isolados, e combinações com a presença de L. crinitus a produção de biomassa foi favorecida. A suplementação do meio de cultivo com RBBR favoreceu a produção de lacase, mas afetou de formas distintas a produção de biomassa. O isolado P. sanguineus não apresentou aumento (p≤0,05) de produção de lacase quando comparado ao meio sem o corante, mas teve a biomassa reduzida (p≤0,05) em 90%. Já o isolado de L. crinitus teve aumento (p≤0,05) de 47% para produção de lacase e 67% de aumento (p≤0,05) na biomassa. E o cocultivo de Lentinus-Pycnoporus aumentou (p≤0,05) em 27% a produção de lacase, no entanto, não foi capaz de aumentar a produção de biomassa neste meio. A descoloração do RBBR foi efetiva em todos os ensaios, mas L. crinitus em monocultura foi capaz de provocar a maior descoloração observada (66%). A presença do corante A220 no meio de cultivo afetou de formas distintas a produção de lacase e biomassa. P. ostreatus em monocultura teve a produção de lacase aumentada (p≤0,05) em 55%, mas apresentou redução na biomassa, enquanto P. sanguineus reduziu (p≤0,05) 23% de lacase e 52% de biomassa. E a combinação de Lentinus-Pycnoporus apresentou as reduções mais expressivas para lacase e biomassa, sendo de 21% e 66% respectivamente. A maior taxa de descoloração para o A220 foi observada para a monocultura de L. crinitus (91%). Já as combinações apresentaram descolorações inferiores ou similares aos seus isolados. A suplementação do corante VM ao meio de cultura afetou o crescimento de todos os cultivos, inibindo crescimento micelial, produção de lacase e descoloração. Para as descolorações in vitro, somente o corante A220 sofreu reduções na cor no intervalo de uma hora, mas as máximas reduções foram observadas em 24 horas, e a combinação Trametes-Pleurotus (90%) foi capaz de provocar a maior (p≤0,05) descoloração. De forma similar, Trametes-Pleurotus também foi capaz de provocar aumento na descoloração para os corantes RBBR (74% em 72 horas) e VM (92% em 72 horas), destacando-se significativamente (p≤0,05) de seus isolados. Já para o corante PT5 a maior redução foi provocada por L. crinitus em monocultura (21%). O efeito positivo do cocultivo mostrou ser dependente das espécies e combinações envolvidas e representa uma alternativa no desenvolvimento de bioprocessos que visem produzir enzimas ou o tratamento de efluentes coloridos.
Palavras-chave
Basidiomicetos, Cocultivo, Lacase, Biomassa, Corantes têxteis, antraquinona, triarilmetano, azo.
Title
Influence of co-culture in mycelial growth, laccase production and decolorization capacity of four basidiomycetes species
Abstract
The effect of co-cultivation of the basidiomycetes Lentinus crinitus U9-1, Pycnoporus sanguineus U13-4, Pleurotus ostreatus U2-11 and Trametes polyzona U16-5 was evaluated on the oxidation of guaiacol in solid medium, laccase production, mycelial growth and decolorization of synthetic dyes in vitro and during fungal growth. The malt-extract-agar medium - MEA (2%) was supplemented with guaiacol to estimate the activity of ligninases and to verify possible interactions of the mycelia in co-cultivation. For the submerged coculture the fungi were cultivated alone and in co-cultivation (in pairs) in malt extract medium without and with the addition of the dyes: RBBR, A220 or VM (0.01%), kept at 28 °C, in the dark for 15 days. The discoloration was monitored every 24 hours. At the end of the cultivation the laccase production was determined by the ABTS oxidation and the mycelium was used in the determination of the dry biomass by thermogravimetric method. The enzymatic extracts obtained at the end of the culture (without supplementation) were used for the discoloration of dye solutions of different chemical classes (0.01%) in sodium acetate buffer pH 5. The discoloration was followed by spectrophotometry for one hour every twenty minutes and every 24 hours for 72 hours. All fungi in co-culture were able to oxidize guaiacol and grow together, but most combinations showed lower color intensity or color similar to that observed in mono-culture. Co-cultivation influenced the production of laccase and biomass in the medium without dye supplementation. For the Trametes-Pleurotus combination, laccase production was 14% higher (p≤0.05) than T. polyzona (30000 U L-1) and 84% higher (p≤0.05) whereas P. ostreatus (18595 U L-1) when isolated, and for this same combination the biomass production was 17% higher (p≤0.05) than both isolates, and combinations with the presence of L. crinitus production biomass was favored. Supplementation of the culture medium with RBBR favored the production of laccase, but it affected the biomass production in different ways. The isolate P. sanguineus did not present increase (p≤0.05) of laccase production when compared to the medium without the dye, but had the biomass reduced (p≤0,05) in 90%. The L. crinitus isolate had an increase (p≤0.05) of 47% for laccase production and 67% increase (p≤0.05) in the biomass. And the co-cultivation of Lentinus-Pycnoporus increased (p≤0.05) by 27% the laccase, however, it was not able to increase biomass production in this medium. The discoloration of RBBR was effective in all trials, but L. crinitus in mono-culture was able to cause the greatest discoloration observed (66%). The presence of the A220 dye in the culture medium affected laccase and biomass production differently. P. ostreatus in mono-culture increased laccase production (p≤0.05) in 55%, but showed reduction in biomass, while P. sanguineus reduced (p≤0.05) 23% laccase and 52% biomass. The combination of Lentinus-Pycnoporus showed the most significant reductions of laccase and biomass, being 21% and 66%, lower respectively. The highest discoloration rate for A220 was observed with mono-culture of L. crinitus (91%), since the combinations showed inferior or similar decolorization then the isolates. Supplementation of the culture medium with VM dye affected the growth of all cultures, inhibiting mycelial growth, laccase production and discoloration. In the in vitro discolorations assays, only the A220 dye was decolorized within one hour, but the maximum reductions were observed in 24 hours, and the Trametes-Pleurotus combination was able to cause the highest (p≤0, 05) discoloration (90%). Similarly, Trametes-Pleurotus was also able to cause discoloration increase for RBBR (74% in 72 hours) and VM (92% in 72 hours), with a significant difference (p≤0.05) from its isolates. For the PT5 dye, the greatest color reduction was caused by L. crinitus in mono-culture (21%). The positive effect of co-cultivation has been shown to be dependent on the species and combinations involved and represent an alternative in the development of bioprocesses that aim to produce enzymes or the treatment of colored effluents.
Keywords
Basidiomycete, Co-cultivation, Laccase, Biomass, Textile dyes, anthraquinone, triarylmethane, azo.