Pesquisa
Marcadores SSR e DNA barcode na discriminação e identificação de genótipos do gênero Capsicum
Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Andira Pricila Dantas
Orientador: Ana Daniela Lopes
Defendido em: 30/04/2021
Resumo
Informações sobre a diversidade genética são essenciais para a caracterização e utilização do germoplasma. O objetivo deste trabalho foi, portanto, estimar a diversidade genética de nove acessos de pimentas do gênero Capsicum spp. por meio de marcadores microssatélites e avaliar a metodologia do DNA Barcode na classificação genética de 21 genótipos de pimentas do mesmo gênero. Para isso, 78 primers foram testados, dos quais 33 apresentaram regiões de amplificação; sendo sete deles polimórficos, os quais foram usados para avaliar a diversidade genética de nove acessos de Capsicum. Um total de 16 alelos foram encontrados a partir de sete primers microssatélites. O polimorfismo médio foi de 38,10%. Os maiores valores de heterozigosidade (Ho = 0,419) foram encontrados nos acessos UFMA 10, enquanto os menores valores (0, 043) foram registrados para o genótipo UFMA 35. Alelos privativos (Ap) foram detectados para dois genótipos UFMA17 e UFMA 35. Os valores de Fst indicaram que 65% da variação total da frequência de alelos nos loci se deve às diferenças genéticas entre os genótipos de Capsicum spp. Os valores de PIC foram maiores que os valores da heterozigosidade esperada e observada em três dos sete loci analisados, menores, em três dos setes loci, e igual, em CAMS-405.O agrupamento das amostras com base na matriz de distância genética de Nei, pelo método NJ revelou a formação de três grupos geneticamente diferentes. O genótipo UFMA35 representou o acesso mais distante em relação aos demais. O gráfico de análise das coordenadas principais revelou que aproximadamente 67,7% de toda variabilidade contida nos genótipos avaliados pode ser explicada pelo plano bidimensional. Os genótipos foram distribuídos em 2 grupos conforme as relações genéticas e, provavelmente, conforme as respectivas espécies. O primeiro grupo indicando que os genótipos UFMA10, UFMA15, UFMA14, UFMA08, UFMA35, UFMA105, mais próximos entre si, diferem do grupo contendo UFMA17, UFMA70 e UFMA18. A partir da técnica de Barcode foram testadas e utilizadas quatro potenciais regiões recomendadas para uso como códigos de barra em genótipos de Capsicum spp: psbA-trnH, matK, rbcL, rpoC1 em 21 acessos de pimentas Capsicum spp. De um total de 79 amostras, 15 não apresentaram produtos de amplificação na PCR e entre 32 amostras encaminhadas para o sequenciamento, 15 não apresentaram sequências com qualidade satisfatória. Desta forma, os marcadores utilizados para o alinhamento das sequências foram rbcL, trnH-psbA e rpoC, realizado por meio do programa MEGA X 10.2 para edição e posterior construção das árvores filogenéticas. Foi possível destacar que os genótipos UFMA11, UFMA12 e UFMA14 avaliados para os três marcadores apresentaram agrupamentos similares, sendo que UFMA11 e UFMA14 mostraram-se mais proximamente relacionados para os três marcadores testados (rbcL, rpoC e psbA-trnH); e UFMA12 mais distante dos demais. Resultado similar foi observado para os genótipos UFMA10 e UFMA56, analisados para os marcadores rbcL e psbA-trnH, os quais também evidenciaram proximidade entre si, sugerindo alta similaridade na sequência. Ainda que se trate de análises distintas, a comparação dos agrupamentos da árvore NJ e dos gráficos PCoA, sugerem, que o marcador psbA revelou maior proximidade entre o genótipo UFMA12 e as espécies C. baccatum var. baccatum e C. annuum var. annum, uma vez que o padrão de agrupamento se repetiu em ambas as análises. As regiões psbA-trnH e rpoC1 apresentaram maior poder discriminatório para os genótipos de Capsicum spp. em relação à região rbcL. Dentre os genótipos analisados, UFMA12 foi aquele no qual os marcadores se mostraram mais informativos, em ambas as análises realizadas, mantendo, com exceção de rbcL, alta similaridade com a sequência da espécie C. baccatum. Os resultados obtidos poderão ser úteis para a identificação dos acessos de Capsicum spp. avaliados e ainda não caracterizados em nível molecular.
Palavras-chave
Microssatélites, Código de barras, Análise de sequências, diversidade genética, pimentas.
Title
SSR MARKERS AND DNA BARCODE IN THE DISCRIMINATION AND IDENTIFICATION OF GENOTYPES OF THE GENUS Capsicum
Abstract
Information on genetic diversity is essential for the characterization and use of germplasm. The objective of this work was, therefore, to estimate the genetic diversity of nine accessions of peppers of the genus Capsicum spp. using microsatellite markers and evaluate the DNA Barcode methodology in the genetic classification of 21 genotypes of peppers of the same genus. For this, 78 primers were tested, of which 33 were presented with amplification regions; seven of them polymorphic, which were used to assess the genetic diversity of nine Capsicum accessions. A total of 16 alleles were found using seven microsatellite primers. The average polymorphism was 38.10%. The highest values of heterozygosity (Ho = 0.419) were found in UFMA 10 accessions, while the lowest values (0.043) were recorded for the UFMA 35 genotype. Private alleles (Ap) were detected for two UFMA17 and UFMA 35 genotypes. Fst values indicated that 65% of the total variation of the frequency of alleles in the loci is due to genetic differences between the genotypes of Capsicum spp. The PIC values were higher than the expected heterozygosity values observed in three of the seven analyzed loci, smaller in three of the seven loci, and the same in CAMS-405. The grouping of the samples based on the Nei genetic distance matrix, by the NJ method revealed the formation of three genetically different groups. The UFMA35 genotype represented the most distant access in relation to the others. The analysis chart of the main coordinates revealed that approximately 67.7% of all the variability contained in the evaluated genotypes can be explained by the two-dimensional plane, the genotypes were distributed in 2 groups according to the genetic relationships and, probably, according to the respective species. The first group indicating that the UFMA10, UFMA15, UFMA14, UFMA08, UFMA35, UFMA105 genotypes, which are closer to each other, differ from the group containing UFMA17, UFMA70 and UFMA18. Using the Barcode technique, four potential regions recommended for use as bar codes in Capsicum spp genotypes were tested and used: psbA-trnH, matK, rbcL, rpoC1 in 21 accessions of Capsicum spp peppers. Of a total of 79 samples, 15 did not present amplification products in the PCR and among 32 samples sent for sequencing, 15 did not present sequences with satisfactory quality. Thus, the markers used for the alignment of the sequences were rbcL, trnH-psbA and rpoC, carried out using the MEGA X 10.2 program for editing and subsequent construction of the phylogenetic trees. It was possible to highlight that the UFMA11, UFMA12 and UFMA14 genotypes evaluated for the three markers and presented similar clusters, with UFMA11 and UFMA14 being more closely related to the three tested markers (rbcL, rpoC and psbA-trnH); and UFMA12 more distant from the others. A similar result was observed for the UFMA10 and UFMA56 genotypes, analyzed for the rbcL and psbA-trnH markers, which also showed proximity to each other, suggesting high similarity in the sequence. Although the analysis of the NJ tree clusters and the PCoA graphs is different, they suggest that, for the psbA marker, it revealed greater proximity between the UFMA12 genotype and the C. baccatum var. baccatum and C. annuum var. annum, since the grouping pattern was repeated in both analyzes. The psbA-trnH and rpoC1 regions showed greater discriminatory power for the Capsicum spp genotypes. in relation to the rbcL region. Among the analyzed genotypes, UFMA12 was the one in which the markers were more informative, in both analyzes performed, maintaining, with the exception of rbcL, high similarity with the sequence of the species C. baccatum. The results obtained may be useful for the identification of the accessions of Capsicum spp. evaluated and not yet characterized at the molecular level.
Keywords
Microsatellites, Barcode, Sequence analysis, genetic diversity, peppers