Pesquisa
Métodos extrativos, identificação química e potencial biológico das folhas, flores e sementes de Pachira aquatica
Doutorado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Isabelle Luiz Rahal
Orientador: Zilda Cristiani Gazim
Defendido em: 27/09/2023
Resumo
A espécie Pachira aquatica (Malvaceae) é uma planta rica em ácidos graxos, flavonoides, ácidos fenólicos, ácidos orgânicos e cumarinas, que se encontram distribuídos em suas folhas, flores e sementes. Para extração do material vegetal, foi utilizado duas formas, a maceração dinâmica com esgotamento de solvente e a extração com fluido pressurizado. Comparando a extração por fluido supercrítico com a extração liquida convencional, pode-se observar algumas vantagens com a primeira, como sua maior rapidez na extração e na separação de fases, extrema facilidade na recuperação de solventes. No capítulo I foi avaliado a capacidade anti-inflamatória, citotóxica e antioxidante celular dos extratos brutos das folhas, flores, sementes e do óleo por prensagem das sementes de P. aquatica. Os extratos brutos das folhas, flores e sementes foram obtidos pelo processo de maceração dinâmica com esgotamento de solvente, utilizando álcool etílico a 80º GL para as folhas, álcool etílico a 77º GL para as flores e álcool etílico a 95º GL para as sementes, respectivamente e o óleo das sementes obtido por prensagem. A identificação química dos extratos brutos foi realizada por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas de alta resolução (UHPLC-MS) e o óleo das sementes por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM). A atividade anti-inflamatória das amostras foi avaliada a partir da inibição da produção de óxido nítrico (IC50). O potencial citotóxico mensurado frente às linhagens de células tumorais humanas: AGS (adenocarcinoma gástrico), Caco-2 (adenocarcinoma colorretal), MCF-7 (adenocarcinoma de mama), NCI-H460 (carcinoma pulmonar) e a linhagem celular não tumoral (Vero). A atividade antioxidante celular (ACC) foi determinada em culturas de células de macrófagos de camundongo (RAW 264.7). A composição química dos extratos evidenciou a presença de ácidos fenólicos: quínico, málico, dicafeoilquínico, p-cumárico, cafeico, clorogênico e benzóico. Dos flavonoides rutina; catequina; quercetina; quercetina-3-glucopiranosídeo; kaempferol; kaempferol-3-O-Glucorhamnoside; kaempferide; quercitrina; apigenina; amentoflavona; morelloflavona e das cumarinas: ácido dicafeoilquínico; 5 hidroxietoxi ayapina; esculetina e 5 metoxiscopoletina. O óleo obtido por prensagem das sementes indicou a presença de ácidos graxos saturados destacando o ácido palmítico (20,13%) como majoritário e 1-hidroxilicopeno (12,51%), ácido 9,12-octadecadienóico, éster etílico (8,74%), ácido oleico (8,13%) e oleato de etila (6,71%). A concentração dos extratos responsáveis por inibir 50% da produção de óxido nítrico variou de (149 a ˃ 400 µg mL-1). A atividade antiproliferativa contra as linhagens tumorais foi: AGS (GI50 175 a ˃ 400 µg mL-1), Caco-2 (GI50 215 a ˃ 400 µg mL-1), MCF7 (GI50 232 a ˃ 400 µg mL-1) e NCI-H460 (GI50 208 a ˃ 400 µg mL-1). A atividade antioxidante celular permaneceu entre 73% e ˃ 2.000%. O índice de seletividade (IS) variou de 1,00 a 2,78 indicando baixa atividade antiproliferativa. As análises químicas e biológicas encontradas neste estudo abrem novas perspectivas para a utilização desta espécie como preservante da oxidação de produtos farmacêuticos, alimentícios e cosméticos. Por sua vez, o capítulo II, teve como objetivo a caracterização química de folhas, flores e sementes de P. aquatica submetidas à extração líquida pressurizada (PLE). O material vegetal foi coletado, sendo as folhas e flores secas à temperatura ambiente (~25 °C); e sementes em estufa 40ºC. O material vegetal foi pulverizado e a granulometria padronizada em 850 µm. Os parâmetros utilizados na extração com líquido pressurizado consistiram na utilização de 15 g de amostra pulverizada; o solvente utilizado foi o álcool etílico (99,3%), duas faixas de temperatura foram utilizadas (25 e 40ºC) e 100 Bar de pressão. O tempo estabelecido foi de 30 min no modo estático, seguido de 120 min de extração dinâmica com um fluxo de solvente de 2.0 mL/min. O rendimento dos extratos foi determinado pela razão entre a massa de extrato bruto obtido (ME) e a massa de amostra inserida no extrator (MS). Para a construção das curvas cinéticas de rendimento, os extratos foram coletados nos tempos 5, 10, 15, 30, 50, 70, 90 e 120 min. O rendimento total de extração das folhas e flores de P. aquatica foram de 70,70 e 87,90 mg extrato/g matéria seca, respectivamente. As sementes apresentaram rendimento total de 109,28 e 290,32 mg extrato/g matéria seca nas temperaturas de 25 e 40 °C, respectivamente. A análise química dos extratos foi realizada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM). Dos parâmetros avaliados a temperatura de 40º C foi a que proporcionou maior rendimento e maior quantidade de princípios ativos identificados nas sementes (40 compostos) com destaque para o éster etílico do ácido oleico. Com relação aos tempos de extração, para as sementes pôde-se observar a partir de 10 minutos a extração de ésteres de ácidos graxos, sendo 70 minutos o melhor tempo de extração, com destaque para o éster etílico (28,84%)’e propilico (23,35%) do ácido hexadecanóico e éster propílico do ácido linoleico (45,60%). Para as folhas, em 5 minutos de extração destacou-se a presença de vitamina E (3,45%), esqualeno (13,52%), gama-sitosterol (13,46%) e em 10 minutos a presença de éster propílico do ácido linoleico (52,16). Para as flores em 10 minutos houve a extração de 1,3-dipalmitina (71,38%) e éster propílico do ácido linoleico (17,28%); em 30 minutos a extração de gama-sitosterol (28,62%) e em 70 e 90 minutos a extração de estigmasterol (7,23%) e (9,87%), respectivamente. Os resultados indicaram que a escolha do método extrativo e dos parâmetros de solvente, temperatura e tempo de extração influenciam na extração das moléculas ativas presentes na planta, acarretando diretamente na resposta biológica.
Palavras-chave
ácido palmítico. flavonoides. catequina. amentoflavona. 1-Hidroxilicopeno
Abstract
The species Pachira aquatica (Malvaceae) is a plant rich in fatty acids, flavonoids, phenolic acids, organic acids and coumarins, which are distributed in its leaves, flowers and seeds. To extract the plant material, two methods were used: dynamic maceration with solvent depletion and extraction with pressurized fluid. Comparing supercritical fluid extraction with conventional liquid extraction, some advantages can be observed with the former, such as faster extraction and phase separation and extreme ease in solvent recovery. In chapter I, the anti-inflammatory, cytotoxic and cellular antioxidant capacity of crude extracts of leaves, flowers, seeds and oil by pressing P. aquatica seeds was evaluated. The crude extracts of leaves, flowers and seeds were obtained by the process of dynamic maceration with solvent exhaustion, using ethyl alcohol at 80º GL for the leaves, ethyl alcohol at 77º GL for the flowers and ethyl alcohol at 95º GL for the seeds, respectively. and seed oil obtained by pressing. The chemical identification of the crude extracts was carried out by ultra-performance liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry (UHPLC-MS) and the seed oil by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS). The anti-inflammatory activity of the samples was evaluated based on the inhibition of nitric oxide production (IC50). The cytotoxic potential measured against human tumor cell lines: AGS (gastric adenocarcinoma), Caco-2 (colorectal adenocarcinoma), MCF-7 (breast adenocarcinoma), NCI-H460 (lung carcinoma) and the non-tumor cell line (Vero ). Cellular antioxidant activity (ACC) was determined in mouse macrophage cell cultures (RAW 264.7). The chemical composition of the extracts showed the presence of phenolic acids: quinic, malic, dicaffeoylquinic, p-coumaric, caffeic, chlorogenic and benzoic. Of the flavonoids rutin; catechin; quercetin; quercetin-3-glucopyranoside; kaempferol; kaempferol-3-O-Glucorhamnoside; kaempferide; quercitrin; apigenin; amentoflavone; morelloflavone and coumarins: dicaffeoylquinic acid; 5 hydroxyethoxy ayapine; esculetin and 5 methoxyscopoletin. The oil obtained by pressing the seeds indicated the presence of saturated fatty acids, highlighting palmitic acid (20.13%) as the majority and 1-hydroxylycopene (12.51%), 9.12-octadecadienoic acid, ethyl ester (8.74 %), oleic acid (8.13%) and ethyl oleate (6.71%). The concentration of extracts responsible for inhibiting 50% of nitric oxide production ranged from (149 to ˃ 400 µg mL-1). The antiproliferative activity against tumor lineages was: AGS (GI50 175 at ˃ 400 µg mL-1), Caco-2 (GI50 215 at ˃ 400 µg mL-1), MCF7 (GI50 232 at ˃ 400 µg mL-1) and NCI-H460 (GI50 208 at ˃ 400 µg mL-1). Cellular antioxidant activity remained between 73% and ˃ 2,000%. The selectivity index (SI) ranged from 1.00 to 2.78 indicating low antiproliferative activity. The chemical and biological analyzes found in this study open new perspectives for the use of this species as a preservative against the oxidation of pharmaceutical, food and cosmetic products. In turn, chapter II aimed to chemically characterize leaves, flowers and seeds of P. aquatica subjected to pressurized liquid extraction (PLE). The plant material was collected, and the leaves and flowers were dried at room temperature (~25 °C); and seeds in a 40ºC oven. The plant material was pulverized and the particle size was standardized at 850 µm. The parameters used in extraction with pressurized liquid consisted of using 15 g of pulverized sample; the solvent used was ethyl alcohol (99.3%), two temperature ranges were used (25 and 40ºC) and 100 Bar pressure. The established time was 30 min in static mode, followed by 120 min of dynamic extraction with a solvent flow of 2.0 mL/min. The yield of the extracts was determined by the ratio between the mass of crude extract obtained (ME) and the mass of sample inserted into the extractor (MS). To construct the kinetic yield curves, the extracts were collected at times 5, 10, 15, 30, 50, 70, 90 and 120 min. The total extraction yield of P. aquatica leaves and flowers were 70.70 and 87.90 mg extract/g dry matter, respectively. The seeds showed a total yield of 109.28 and 290.32 mg extract/g dry matter at temperatures of 25 and 40 °C, respectively. The chemical analysis of the extracts was carried out using gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS). Of the parameters evaluated, the temperature of 40º C was the one that provided the highest yield and greatest quantity of active ingredients identified in the seeds (40 compounds), with emphasis on oleic acid ethyl ester. Regarding extraction times, for seeds, the extraction of fatty acid esters could be observed from 10 minutes onwards, with 70 minutes being the best extraction time, with emphasis on ethyl ester (28.84%)' and propyl ester (23.35%) of hexadecanoic acid and propyl ester of linoleic acid (45.60%). For the leaves, in 5 minutes of extraction the presence of vitamin E (3.45%), squalene (13.52%), gamma-sitosterol (13.46%) stood out and in 10 minutes the presence of propyl ester of linoleic acid (52.16). For the flowers, in 10 minutes, 1,3-dipalmitin (71.38%) and linoleic acid propyl ester (17.28%) were extracted; in 30 minutes the extraction of gamma-sitosterol (28.62%) and in 70 and 90 minutes the extraction of stigmasterol (7.23%) and (9.87%), respectively. The results indicated that the choice of extraction method and solvent parameters, temperature and extraction time influence the extraction of active molecules present in the plant, directly resulting in the biological response.
Keywords
palmitic acid. flavonoids. catechin. amentoflavone. 1-Hydroxylycopene