Pesquisa
Perda e plasticidade neuronal mientérica no jejuno de ratos infectados por taquizoítos de Toxoplasma gondii
Mestrado em Ciência Animal com Ênfase em Produtos Bioativos
Autor: José Ricardo Paintner Torres
Orientador: Débora de Mello Gonçales Sant’Ana
Defendido em: 27/02/2008
Resumo
Objetivou-se avaliar as alterações causadas por duas cepas de Toxoplasma gondii, uma do tipo I e outra do tipo III, sobre os neurônios do plexo mientérico do jejuno de ratos, através de quantificação e morfometria. Para tanto, utilizaram-se vinte e oito ratos (Rattus norvegicus) Wistar machos, com sessenta dias de idade mantidos em caixas com grades individuais num biotério com temperatura constante de 25º C e alternância de ciclos claro-escuro de 12 horas. Todos os animais receberam ração comercial para roedores (NUVITAL®) e água ad libitum. Os animais foram divididos em seis grupos. Quatro grupos participaram do experimento com infecção aguda e crônica, causada por uma cepa genótipo III (Experimento A): grupo controle agudo (GCA, n = 4), grupo experimental agudo (GEA, n = 4), grupo controle crônico (GCC, n = 5) e grupo experimental crônico (GEC, n = 5). Os animais do GEA e GEC receberam 104 taquizoítos por via oral. Dois grupos participaram do experimento com infecção crônica causada por uma cepa genótipo I (Experimento B): grupo controle (GC, n = 5) e grupo experimental (GE, n = 5), sendo este inoculado por via oral com 105 taquizoítos. Os animais pertencentes aos grupos GCA e GEA do Experimento A foram submetidos à eutanásia 24 horas após a infecção (fase aguda), e os grupos GCC e GEC do Experimento A, assim como, todos os grupos do experimento B, 30 dias após a infecção (fase crônica). No momento da eutanásia cada animal foi anestesiado, visando laparotomia para retirada do jejuno, e colheita de sangue por intermédio de punção, através do plexo retro-orbital, no caso dos animais do GCC e GEC do experimento A e de todos do experimento B. Através do método de aglutinação direta, o sangue coletado foi processado, para detecção da presença de anticorpos anti-T. gondi. Após retirada os segmentos intestinais descritos acima foram lavados e fixados, utilizando formol acético. Em seguida, foram dissecados, com retirada da túnica mucosa e tela submucosa, restando preparados totais formados pela túnica muscular e serosa, os quais foram corados pela técnica de Giemsa. De cada animal foi contado o número total de neurônios mientéricos em 120 campos microscópicos (ampliados 400 vezes), distribuídos uniformemente por toda a circunferência intestinal. Além disso, foi mensurado a área do pericário, do núcleo e do citoplasma de 300 neurônios do plexo mientérico de cada animal. Os dados foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov, para verificar o tipo de distribuição, sendo expressos como média ± desvios-padrão, os dados de distribuição normal e os demais como mediana e percentis 25 e 75 (P25 e P75). Para comparar os dados entre os grupos controle e experimental, utilizou-se o teste t de Student para dados com distribuição normal e o teste de Mann-Whitney para os de distribuição livre. Todos os animais experimentais submetidos ao exame sorológico, tiveram resultado positivo para presença de anti-T. gondii, enquanto os dos grupos controle tiveram resultado negativo. Quanto aos resultados, no experimento A: não foram observadas alterações nas dimensões dos segmentos intestinais coletados dos grupos agudos, porém foi observado redução no comprimento, largura e área do jejuno-íleo dos animais do grupo GEC (p<0,05). Como a redução da área intestinal foi de 17,5% e não houve aumento do número de neurônios, conclui-se que houve perda neuronal da mesma ordem na infecção crônica. Durante a infecção aguda, observou-se hipertrofia nos neurônios mientéricos, já na infecção crônica (30 dias), constatou-se redução da área nuclear e da razão núcleo/pericário. Quanto à freqüência de neurônios divididos em classes de acordo com a área do pericário, observa-se que a maior parte se concentra num espectro de entre 51 e 200 m2. A infecção crônica provocou uma redução do número de neurônios com área de pericário entre 151 e 200 m2. Quanto aos resultados do experimento B, observou-se que não houve alteração nas dimensões do órgão coletado, bem como perda neuronal. Os neurônios do jejuno tornaram-se atróficos. Não houve alteração na freqüência de neurônios nas diferentes classes. Conclui-se que a infecção por uma cepa brasileira do tipo III do T. gondii por 24 horas não levou a perda neuronal, porém, induziu à respostas plásticas que culminaram na hipertrofia neuronal. A infecção crônica pela mesma cepa levou a redução neuronal e da área nuclear. Conclui-se também que ratos infectados por 30 dias por taquizoítos de uma cepa de genótipo I não levou a perda neuronal, porém induziu hipertrofia dos neurônios mientéricos do jejuno.
Palavras-chave
Toxoplasmose; Sistema Nervoso Entérico; Morfologia
Title
Myenteric neuronal plasticity and loss in the rat jejunum infected by Toxoplasma gondii tachyzoites
Abstract
The alterations caused by two Toxoplasma gondii strains – type I and III, on the neurons in the myenteric plexus of rat jejunum was assessed by quantification and morphometry. Twenty-eight, male, 60-day-old, Wistar rats (Rattus norvegicus), kept in boxes with individual grids, in a bioterium constantly at 25.°C with 12-hr dark-bright alternate cycles were used. All the animals received rat chow (NUVITAL®) and water ad libitum and were divided into 6 groups: There were four groups with acute and chronic infection caused by a Genotype II strain (Experiment A): Acute Control group (ACG, n = 4) Acute Experimental Group (AEG, n = 4), Chronic Control Group (CCG, n = 5), and Chronic Experimental Group (CEG, n = 5). The animals from AEG and CEG received 104 tachyzoites orally. There were two groups with chronic infection caused by a Genotype I strain (Experiment B): Control Group (CG, n = 5) and Experimental Group (EG, n = 5), which was orally inoculated with 105 tachyzoites. ACG and AEG animals from Experiment A were submitted to euthanasia 24 hours after infection (acute phase), and CCG and CEG animals from Experiment A, as well as animals from Experiment B, after 30 days (chronic phase). At the euthanasia, every animal was anesthetized for laparotomy in order to remove the jejunum and collect blood by puncture through the retro-orbital plexus of the CCG and CEG animals from Experiment A and all animals from Experiment B. The blood collected was processed in order to identify the presence of anti-T. gondii antibodies by the direct agglutination test. After the removal, the intestinal segments described above were washed and fixed by using acetic formol. They were then dissected by removing the tunic and the submucosal net. Whole-mounted preparations formed by the muscle tunic and the serous membrane which were stained with Giemsa stain. The total number of myenteric neurons, within 120 microscopic fields (magnified 400 times), uniformly distributed all around the intestinal circumference, was counted in each animal. Moreover, the soma, nucleus, and the cytoplasm area of 300 neurons in the myenteric plexus of each animal was measured. The data were submitted to the Kolmogorov-Smirnov test in order to verify the type of distribution, expressed as means standard±deviations; data from the normal distribution and the others as mediana and percentiles 25 and 75 (P25 & P75). Student´s t-test was used for normal distribution data and Mann-Whitney test for free distribution data in order to compare Control and Experimental Groups. All experimental groups submitted to a serologic test presented positive results with respect to the presence of anti- T. gondii, whereas the Control Groups presented negative results. Concerning the results, in Experiment A: alterations in the dimensions of the intestinal segments collected from the Acute Groups were not observed even though there were a reduction in the length, width, and area of the ileum-jejunum for the animals in the ECG (p<0.05). As the intestinal area reduction was 17.5%, and there was not an increase in the number of neurons, it is concluded that there were not any neuronal losses as a result of chronic infection as well. Hypertrophy was observed for the myenteric neurons during acute infection, whereas reduction of the nuclear area and the nucleus/soma ratio was noted for chronic infection (30 days). With respect to the frequency of neurons divided into classes according to the soma are, it was observed that most of them are within a range of 51-200 µm2. Chronic infection provoked a reduction of the number of neurons with soma área between 151 and 200 µm2. With respect to the results from Experiment B, there were not any alterations in the dimensions of the organs collected, as well as neuronal loss. The neurons in the jejunum became atrophic. There were not any alterations in the frequency of the neurons within the different classes. It was concluded that the infection by a Brazilian Genotype I T. gondii strain for 24 hours did not result in any neuronal losses; however, it induced to plastic responses which ended up in neuronal hypertrophy. Chronic infection by the same strain resulted in the reduction in the number of neurons and nuclear area. It was also concluded there were not any neuronal losses rats infected with tachyzoites from a Genotype I strain for 30 days; however, hypertrophy of the jejunum myenteric neurons was induced.
Keywords
Toxoplasmosis; Enteric Nervous System; Morphology