Pesquisa
Perfil de resistência de isolados bacterianos da cavidade oral de cães domiciliados e uso terapêutico de extratos de plantas medicinais.
Doutorado em Ciência Animal com Enfase em Produtos Bioativos
Autor: Isabel Cristina da Silva Caetano
Orientador: Daniela Dib Gonçalves
Defendido em: 28/04/2022
Resumo
Na medicina, são consideradas plantas medicinais, todas as espécies capazes de sintetizar compostos químicos que apresentem potencial terapêutico. Pesquisas utilizando plantas medicinais com ação antibacteriana têm sido realizadas afim de buscar o desenvolvimento de terapias alternativas como estratégias terapêuticas contra microrganismos resistentes aos antibióticos convencionais. Essa resistência vem aumentando pelo uso indiscriminado de antibióticos que aumentam a pressão seletiva e consequente compartilhamento do perfil de resistência, aumenta a frequência de patógenos resistentes, acarretando problemas em nível de saúde única. Os objetivos neste trabalho foram identificar o perfil fenotípico e molecular de isolados bacterianos com potencial de resistência da cavidade oral de cães domiciliados com diferentes graus de doença periodontal, fazer análise fitoquímica e investigar a ação antibacteriana dos extratos de Foeniculum vulgare Mill. (erva doce), Plantago australis Lam. (tansagem), Terminalia catappa (sete copas) e Petroselinum vulgare Lag. (salsinha), frente a isolados bactérianos gram-positivas e gram-negativas. Foram coletadas amostras por meio de swab da cavidade oral de 40 cães domiciliados com doença periodontal. Após a coleta, as amostras foram processadas para o isolamento bacteriano, identificação fenotípica por meio de provas bioquímicas, testes de disco difusão, pesquisa para identificação de Staphylococcus aureus, pesquisa de gene mecA, teste fenotípico para detecção de enterobactérias produtoras de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL), determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) frente a esses isolados e análises fitoquímicas dos extratos hidroalcoólicos de F. vulgare Mill., P. australis Lam., T. catappa e P. vulgare Lag. Das 40 amostras isoladas dos cães, 21 (52,5%) fêmeas e 19 (47,5%) machos. Foi possível isolar 82 cepas bacterianas, dentre as quais 40/82 (48,8%) eram bactérias gram-positivas e 42/82 (51,2%) eram bactérias gram-negativas. Entre os gram-positivos 23/40 (57,5%) foram identificados como Staphylococcus spp., sendo 13/23 (56,5%) classificados como Staphylococcus coagulase positiva (CoPS) e 10/23 (43,5%) como Staphylococcus coagulase negativo (CoNS). Nenhum isolado de CoPS foi identificado como Staphylococcus aureus e nos isolados resistentes à oxacilina (n=2) não foi detectado o gene mecA. Em relação à resistência antimicrobiana, verificou-se que os isolados de CoPS e CoNS apresentaram-se resistentes a antimicrobianos da classe dos beta-lactâmicos. Os CoPS apresentaram percentual de resistência para penicilina (38,5%) e ampicilina (30,8%) e os CoNS para ampicilina (60,0%) e penicilina (50,0%). Dentre os isolados gram-negativos, foram identificados 15/42 (35,7%) enterobactérias, sendo cinco Enterobacter aerogenes, quatro Escherichia coli, três Klebsiella pneumoniae, dois Enterobacter cloacae e um Proteus mirabilis. A resistência antimicrobiana das enterobactérias apresentaram percentual de resistência para amoxicilina e ampicilina com 73,3%, seguido de norfloxacino (46,7%) e cefoxitina (40%). Um (6,6%) isolado foi positivo para a produção de ESBL no teste sinérgico do duplo disco, tendo seu genoma parcialmente sequenciado e identificado como Escherichia coli. A avaliação da CIM dos diferentes extratos de plantas avaliados no presente trabalho demonstrou para as amostras identificadas como CoPS quanto para os CoNS, a menor CIM foi obtida para T. catappa, com média respectivamente de 0,5 e 2 mg/mL. Resultado semelhante foi obtido para as enterobactérias, no qual a T. catappa apresentou menor média de CIM para todos os isolados identificados. A bactéria Enterobacter aerogenes (5/15) foi a que apresentou a maior quantidade de isolados, porém não foi possível determinar a CIM para os extratos de F. vulgare Mill. e P. australis Lam., já a bactéria Escherichia coli (4/15) em todos os isolados foi possível determinar a CIM e a maior média foi obtida para F. vulgare com 175 mg/mL. As análises fitoquímicas por Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência e Espectrometria de Massas de Alta Resolução demonstraram a presença de diferentes compostos bioativos em cada um dos extratos avaliados, no qual os ácidos fenólicos e flavonóides estavam presentes em todos os extratos. O extrato de T. catappa*, que apresentou os melhores resultados de CIM apresentou predomínio de flavonóides (Isoquercetina, Rutina, Quercitrina, Kaempferol, Quercetina, Quercetina, Kaempferol-6-metoxi-3-O-glucosídeo, Kaempferol-7-O-rhamnosideo e Nicotiflorina). Por outro lado, apesar do extrato de P. vulgare Lag. também ter apresentado maior predomínio de flavonóides (Luteolina, Apigenina, Apiina, Kaempferol-6-metoxi-3-O-rhamnosideo, Kaempferol-6-metoxi-3-O-glucosideo, Apigenina-5-metoxi e Apigenina-7-O-glucosídeo), o mesmo apresentou os maiores valores de CIM para os isolados gram-positivos e gram-negativos. Esses resultados podem estar associados às diferenças da composição dos compostos bioativos presentes em cada extrato, mas que não foram quantificados no presente trabalho e pela própria natureza dos isolados que se mostraram resistentes a vários antibióticos. Estes resultados sugerem que os cães domiciliados podem ser considerados como reservatórios de microrganismos resistentes, e a utilização de plantas e sua grande diversidade contribui para a obtenção de novas moléculas, que podem auxiliar no controle e/ou redução da resistência bacteriana alcançando os alvos intracelulares.
Palavras-chave
Antimicrobiano. Enterobactérias. Mucosa oral. Staphylococcus spp. Saúde Única. Compostos Bioativos.
Title
Resistance profile of bacterial isolates from the oral cavity of domiciled dogs and terapêutico use of medicinal plants extracts.
Abstract
In medicine, medicinal plants are all species capable of synthesizing chemical compounds that have therapeutic potential. Research using medicinal plants with antibacterial action has been carried out in order to seek the development of alternative therapies as therapeutic strategies against microorganisms resistant to conventional antibiotics. This resistance has been increasing due to the indiscriminate use of antibiotics that increase selective pressure and the consequent sharing of the resistance profile, increases the frequency of resistant pathogens, causing problems at a unique health level. The objectives of this work were to identify the phenotypic and molecular profile of bacterial isolates with resistance potential from the oral cavity of domiciled dogs with different degrees of periodontal disease, perform a phytochemical analysis and investigate the antibacterial action of extracts of Foeniculum vulgare Mill. (Fennel), Plantago australis Lam. (Ribwort plantain), Terminalia catappa (Seven crowns) and Petroselinum vulgare Lag. (Parsley), against gram-positive and gram-negative bacterial isolates. Samples were collected by means of swab from the oral cavity of 40 dogs domiciled with periodontal disease. After collection, the samples were processed for bacterial isolation, phenotypic identification by means of biochemical tests, disk diffusion tests, research for the identification of Staphylococcus aureus, mecA gene research, phenotypic test for the detection of enterobacteriaceae producing beta-lactamases from extended spectrum (ESBL), determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) against these isolates and phytochemical analyzes of hydroalcoholic extracts of F. vulgare Mill., P. australis Lam., T. catappa and P. vulgare Lag. Of the 40 samples isolated from the dogs, 21 (52.5%) were females and 19 (47.5%) were males. It was possible to isolate 82 bacterial strains, among which 40/82 (48.8%) were gram-positive bacteria and 42/82 (51.2%) were gram-negative bacteria. Among the gram-positives, 23/40 (57.5%) were identified as Staphylococcus spp., with 13/23 (56.5%) classified as coagulase-positive Staphylococcus (CoPS) and 10/23 (43.5%) as Coagulase negative Staphylococcus (CoNS). No CoPS isolate was identified as Staphylococcus aureus and in the oxacillin-resistant isolates (n=2) the mecA gene was not detected. Regarding antimicrobial resistance, it was found that CoPS and CoNS isolates were resistant to antimicrobials of the beta-lactam class. CoPS showed a percentage of resistance to penicillin (38.5%) and ampicillin (30.8%) and CoNS to ampicillin (60.0%) and penicillin (50.0%). Among the gram-negative isolates, 15/42 (35.7%) enterobacteria were identified, being five Enterobacter aerogenes, four Escherichia coli, three Klebsiella pneumoniae, two Enterobacter cloacae and one Proteus mirabilis. The antimicrobial resistance of enterobacteria showed a percentage of resistance to amoxicillin and ampicillin with 73.3%, followed by norfloxacin (46.7%) and cefoxitin (40%). One (6.6%) isolate was positive for ESBL production in the double-disk synergistic test, having its genome partially sequenced and identified as Escherichia coli. The evaluation of the MIC of the different plant extracts evaluated in the present work showed, for the samples identified as CoPS and for the CoNS, the lowest MIC was obtained for T. catappa, with an average of 0.5 and 2 mg/mL respectively. A similar result was obtained for Enterobacteriaceae, in which T. catappa had the lowest mean MIC for all identified isolates. The bacterium Enterobacter aerogenes (5/15) presented the highest number of isolates, but it was not possible to determine the MIC for the extracts of F. vulgare Mill. and P. australis Lam., whereas the bacterium Escherichia coli (4/15) in all isolates was possible to determine the MIC and the highest average was obtained for F. vulgare with 175 mg/mL. Phytochemical analyzes by Ultra Performance Liquid Chromatography and High Resolution Mass Spectrometry demonstrated the presence of different bioactive compounds in each of the evaluated extracts, in which phenolic acids and flavonoids were present in all extracts. The T. catappa extract, which presented the best MIC results, showed a predominance of flavonoids (Isoquercetin, Rutin, Quercitrin, Kaempferol, Quercetin, Quercetin, Kaempferol-6-methoxy-3-O-glucoside, Kaempferol-7-O-rhamnoside and nicotiflorine). On the other hand, despite the extract of P. vulgare Lag. flavonoids (Luteolin, Apigenin, Apiin, Kaempferol-6-methoxy-3-O-rhamnoside, Kaempferol-6-methoxy-3-O-glucoside, Apigenin-5-methoxy and Apigenin-7-O- glucoside), it showed the highest MIC values for gram-positive and gram-negative isolates. These results may be associated with differences in the composition of the bioactive compounds present in each extract, which were not quantified in the present work and due to the very nature of the isolates that proved to be resistant to several antibiotics. These results suggest that domestic dogs can be considered as reservoirs of resistant microorganisms, and the use of plants and their great diversity contributes to obtaining new molecules, which can help to control and/or reduce bacterial resistance, reaching intracellular targets.
Keywords
Antimicrobial. Enterobacteria. Oral mucosa. Staphylococcus spp. Unique Health. Bioactive compounds.