Pesquisa
Produção de enzimas ligninolíticas de fungos basidiomicetos: uma opção para biodegradação de anti-inflamatórios não esteroidais (AINES)
Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Adma Soraia Serea Kassem
Orientador: Juliana Silveira do Valle
Defendido em: 24/04/2021
Resumo
Fármacos são microcontaminantes que chegam ao ambiente via atividades humanas como a excreção na urina e fezes, descarte e efluentes industriais. Anti-inflamatórios não-esteroidais (AINES) como o diclofenaco e o ibuprofeno são fármacos amplamente consumidos e que podem ser detectados no ambiente. A biorremediação mediada por enzimas de fungos basidiomicetos é uma alternativa para a remoção de fármacos da água. O objetivo deste estudo foi produzir enzimas ligninolíticas de Lentinus crinitus e Panus strigellus e avaliar sua capacidade de degradar diclofenaco e ibuprofeno. Cinco linhagens de L. crinitus (U18-11, U19-1, U19-2, U19-3 e U19-4) e uma de P. strigellus (U16-7) foram cultivadas em meio líquido contendo ibuprofeno ou diclofenaco (0, 0,2, 2, 20 ou 200 μg/mL) a 28 ºC, em cultivo estático e sob agitação. No 15º dia determinaram-se a produção de biomassa micelial e as atividades de lacase, manganês e lignina peroxidase. A avaliação da biodegradação dos fármacos foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) utilizando acetonitrila (60%) pH 4 como fase móvel, isocrático. P. strigellus U16-7 e L. crinitus U19-1 apresentaram maior atividade de lacase em cultivo estático e presença de 0,2 µg/mL de ibuprofeno aumentou 17 vezes a atividade de lacase de P. strigellus. A agitação combinada com ibuprofeno reduziu a atividade de lacase de U19-3. A agitação combinada com 0,2 µg/mL de ibuprofeno triplicou a atividade de lacase de L crinitus U19-4. Para os cultivos contendo diclofenaco as maiores atividades de lacase ocorreram sob cultivo estático. A presença de 20 µg/mL de diclofenaco aumentou a atividade de lacase de P. strigellus U16-7 e L. crinitus U19-3 e U19-4. A agitação combinada com a adição do diclofenaco reduziu e até inibiu a atividade de todas as linhagens comparado ao controle sem diclofenaco. Todas as linhagens cresceram em meio contendo as diferentes concentrações dos fármacos, exceto na concentração de 200 µg/mL que inibiu totalmente o crescimento. Nos meios com ibuprofeno, de modo geral, as linhagens produziram mais biomassa micelial em cultivo sob agitação e a adição de 0,2 µg/mL aumentou a biomassa de P. strigellus U16-7 em 2,7 vezes. Para o restante das linhagens a agitação combinada com a adição de ibuprofeno não afetou a biomassa, exceto para L. crinitus U19-1 que na presença de 20 µg/mL reduziu a biomassa em 46%. O diclofenaco no cultivo agitado aumentou a biomassa de todas as linhagens, porém, com 20 µg/mL reduziu a biomassa de L. crinitus U18-11 (31%) e U19-2 (35%). O cultivo estático com 0,2 µg/mL de ibuprofeno aumentou a razão enzima-biomassa de P. strigellus U16-7 e L. crinitus U19-1 em 188 vezes e 70 vezes, respectivamente. Para o diclofenaco a relação foi maior sob cultivo estático para todas as linhagens. Não se detectou atividade de manganês e lignina peroxidase para nenhuma das linhagens. Lentinus crinitus U18-11 cultivado na presença de 2 e 20 µg/mL de ibuprofeno degradou o fármaco. No cultivo estático a concentração do fármaco foi reduzida a níveis não detectáveis e sob agitação a redução foi de 86% na presença de 20 µg/mL de ibuprofeno. Na escolha de fungos para uso em biodegradação de fármacos é importante analisar a tolerância a diferentes concentrações de fármaco, além das condições ideais de cultivo. As linhagens testadas mostraram potencial para uso em biorremediação de água contaminada com AINES.
Palavras-chave
Biorremediação, diclofenaco, fungo da podridão branca, ibuprofeno, ligninase, micélio.
Title
Production of ligninolytic enzymes of basidiomycete fungi: an option for biodegradation of non-steroidal anti-inflammatory drugs (nsaids)
Abstract
Drugs are microcontaminants that reach the environment through human activities such as excretion in urine and feces, waste, and industrial effluents. Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) such as diclofenac and ibuprofen are widely used drugs that can be detected in the environment. Bioremediation mediated by enzymes of basidiomycete fungi is an alternative for the removal of drugs from water. The aim of this study was to produce Lentinus crinitus and Panus strigellus ligninolytic enzymes and to evaluate their ability to degrade diclofenac and ibuprofen. Five strains of L. crinitus (U18-11, U19-1, U19-2, U19-3, and U19-4) and one of P. strigellus (U16-7) were grown in liquid medium containing ibuprofen or diclofenac (0, 0.2, 2, 20, or 200 μg/mL) at 28 ºC, in static culture, and under agitation. On the 15th day, the production of mycelial biomass and the activities of laccase, manganese, and lignin peroxidase were determined. The evaluation of the biodegradation of the drugs was performed by high-performance liquid chromatography (HPLC) using acetonitrile (60%) pH 4 as a mobile, isocratic phase. P. strigellus U16-7 and L. crinitus U19-1 presented higher laccase activity in static culture and the presence of 0.2 µg/mL of ibuprofen increased 17 times the laccase activity of P. strigellus. Agitation combined with ibuprofen reduced the U19-3 laccase activity. The agitation combined with 0.2 µg/mL of ibuprofen tripled the laccase activity of L crinitus U19-4. For cultures containing diclofenac, the largest laccase activities occurred under static cultivation. The presence of 20 µg/mL of diclofenac increased the laccase activity of P. strigellus U16-7, L. crinitus U19-3 and U19-4. Stirring combined with the addition of diclofenac reduced and even inhibited the activity of all strains compared to the control without diclofenac. All strains grew in a medium containing different concentrations of drugs, except for the concentration of 200 µg/mL that completely inhibited growth. In ibuprofen media, in general, the strains produced more mycelial biomass in cultivation under agitation and the addition of 0.2 µg/mL increased the biomass of P. strigellus U16-7 by 2.7 times. For the other strains, agitation combined with the addition of ibuprofen did not affect the biomass, except for L. crinitus U19-1, which in the presence of 20 µg/mL reduced the biomass by 46%. Diclofenac in the agitated culture increased the biomass of all strains, however, with 20 µg/mL it reduced the biomass of L. crinitus U18-11 (31%) and U19-2 (35%). Static culture with 0.2 µg/mL of ibuprofen increased the enzyme-biomass ratio of P. strigellus U16-7 and L. crinitus U19-1 by 188 times and 70 times, respectively. For diclofenac, the ratio was higher under static cultivation for all strains. No manganese or lignin peroxidase activities were detected for any of the strains. Lentinus crinitus U18-11 grown in the presence of 2 and 20 µg/mL of ibuprofen degraded the drug. In static culture, the drug concentration was reduced to undetectable levels and under agitation, the reduction was 86% in the presence of 20 µg/mL of ibuprofen. When choosing fungi for use in drug biodegradation, it is important to analyze the tolerance to different drug concentrations, in addition to the ideal culture conditions. The tested strains showed potential for use in bioremediation of water contaminated with NSAIDs.
Keywords
Bioremediation, diclofenac, ibuprofen, ligninase, mycelium, white-rot fungus.