Pesquisa
Produção de lacase de fungos basidiomicetos cultivados sob diferentes condições abióticas
Doutorado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Juliana Cristhina Friedrich
Orientador: Juliana Silveira do Valle
Defendido em: 30/11/2019
Resumo
Lacases são enzimas comuns a vários organismos, mas a maioria é de origem fúngica. Sua síntese e secreção são afetadas pelos níveis de nutrientes, condições de cultivo e adição de compostos fenólicos ou aromáticos que atuam como indutores da atividade. Os objetivos do presente trabalho foram selecionar macrofungos com capacidade para produção de enzimas ligninolíticas e degradação de corantes e investigar a influência da luz, presença e combinação de indutores, temperatura e pH inicial do meio de cultivo na atividade de lacase e produção de biomassa micelial. Para tanto, seis linhagens de basidiomicetos (U15-3, U15-6, U15-7, U15-8, Trametes polyzona U16-5 e U16-8) foram estudadas. A análise qualitativa foi realizada em meio ágar extrato de malte (AEM) 2% suplementado com guaiacol 0,01% ou diferentes corantes a 0,1%. Resultados positivos foram usados nos ensaios enzimáticos em cultivo submerso com agitação e estático. O extrato enzimático foi empregado para descolorir o corante remazol azul brilhante R (RBBR). A produção de lacase e biomassa micelial em meios de cultivo submerso (Pontecorvo e/ou extrato de malte 2%) e diferentes condições abióticas (luminosidade, presença de indutores químicos, temperatura e/ou pH inicial) foram testadas. A linhagem U15-3 apresentou maior halo castanho-avermelhado (25,39 mm), confirmando a capacidade ligninolítica desses fungos. Todas as linhagens cresceram em meio contendo diferentes corantes e destas, 80% formaram halo de descoloração. As linhagens se mostraram promissoras na degradação do corante RBBR. Exceto a linhagem U15-7, as demais demonstraram potencial para produção de lacase. A linhagem T. polyzona U16-5 apresentou atividade diferenciada quando cultivada com agitação (13405 U L-1) e, apesar de maior produtora de lignina peroxidase (969 U L-1), não diferenciou estatisticamente das outras linhagens. Os ensaios não revelaram atividade de manganês peroxidase. O cultivo das diferentes linhagens em meio extrato de malte favoreceu a produção de lacase e de biomassa micelial em comparação ao meio Pontecorvo, especialmente após 14 dias de cultivo. A luz azul, de modo geral, reduziu a atividade de lacase sem afetar a biomassa micelial quando o cultivo ocorreu em meio extrato de malte. As luzes verde e vermelha reduziram a atividade de lacase e mostraram efeitos variados sobre a biomassa, dependendo da linhagem. Na ausência de luz, o guaiacol em meio extrato de malte foi o único que induziu a atividade de lacase das linhagens avaliadas, enquanto vanilina e xilidina atuaram na indução de lacase de apenas algumas. As induções mais expressivas da atividade de lacase foram observadas para T. polyzona U16-5 causada pela vanilina (95%), guaiacol (89%) e xilidina (84%). A biomassa também foi afetada pela presença de indutores químicos, sendo que todos produziram efeitos distintos dependendo da linhagem. Na ausência de indutor, a luz vermelha não afetou a atividade de lacase da maioria das linhagens e a produção enzimática e a biomassa micelial durante o cultivo na presença concomitante de luz e indutor químico resultaram da interação das variáveis (p≤0,05). As linhagens demonstraram comportamento distinto quando cultivadas sob diferentes temperaturas e pH iniciais do meio de cultivo. 50% (U15-3, U15-6 e U15-8) apresentaram correlação entre temperatura de cultivo e atividade de lacase, 83% (U15-6, U15-7, U15-8, T. polyzona U16-5 e U16-8) entre temperatura e produção de biomassa e 67% das linhagens (U15-6, U15-7, U15-8 e T. polyzona U16-5) mostraram correlação entre produção de lacase e crescimento micelial. Para o pH, notou-se correlação deste com a atividade de lacase para T. polyzona U16-5 e entre produção enzimática e biomassa micelial para a U15-6. Conclui-se que na triagem de linhagens para uso em processos industriais é importante analisar indutores em potencial e diferentes combinações de iluminação, além de condições favoráveis de cultivo.
Palavras-chave
Polifenoloxidase. Biomassa micelial. Indutores de lacase. Fungos da podridão branca.
Title
Laccase production of basidiomycete fungi grown under different abiotic conditions
Abstract
Laccases are enzymes common to many organisms, but most are of fungal origin. Its synthesis and secretion are affected by nutrient levels, growing conditions and the addition of phenolic or aromatic compounds that act as activity inducers. The objectives of the present work were to select macrofunges with capacity for ligninolytic enzyme production and dye degradation and investigate the influence of light, presence and combination of chemical inducers, temperature and initial pH of the culture medium on laccase activity and mycelial biomass production. To address this issue, six strains of basidiomycetes (U15-3, U15-6, U15-7, U15-8, Trametes polyzona U16-5 and U16-8) were studied. The qualitative analysis was performed on malt extract agar medium (AEM) 2% supplemented with 0.01% guaiacol or 0.1% of different dyes. Positive results were used in enzymatic assays in submerged culture with shaking and static. The enzymatic extract was used to discolor the remazol brilliant blue R dye (RBBR). The production of laccase and mycelial biomass in submerged culture media (Pontecorvo and/or 2% malt extract) and different abiotic conditions (lighting, presence chemical inducers, temperature and/or initial pH) were evaluated. The U15-3 strain presented larger reddish-brown halo (25.39 mm), confirming the ligninolytic capacity of these fungi. All strains were grown in medium containing different dyes and 80% of these have formed a discoloration halo. The strains showed potential in the degradation of the RBBR dye. Except for the U15-7 strain, the others showed potential for laccase production. The strain T. polyzona U16-5 showed different activity when cultivated with shaking (13405 U L-1) and even though higher lignin peroxidase producer (969 U L-1), it has not differentiated statistically from other strains. The assays did not reveal manganese peroxidase activity. Cultivation of the different strains in malt extract medium favored the production of laccase and mycelial biomass compared to Pontecorvo medium, especially after 14 days of cultivation. In general, blue light reduced laccase activity without affecting mycelial biomass when cultivation occurred on malt extract medium. In addition, green and red lights reduced laccase activity and showed varying effects on biomass, depending on each strain. In the absence of light, guaiacol in malt extract medium was the only one that induced laccase activity of the evaluated strains, whereas vanillin and xylidine induced laccase only in a few strains. The most significant inductions of laccase activity were observed for T. polyzona U16-5 caused by vanillin (95%), guaiacol (89%) and xylidine (84%). Biomass was also affected by the presence of chemical inducers, all of which produced distinct effects depending on the strain. In the absence of inducer, red light did not affect laccase activity of most strains and enzyme production and mycelial biomass during cultivation in the concomitant presence of light and chemical inducer resulted from the interaction of variables (p≤0.05). The strains showed different behavior when cultivated under different temperatures and initial pH of the culture medium. 50% (U15-3, U15-6 and U15-8) showed a correlation between culture temperature and laccase activity, 83% (U15-6, U15-7, U15-8, T. polyzona U16-5 and U16-8) showed correlation between temperature and biomass production and 67% of the strains (U15-6, U15-7, U15-8 and T. polyzona U16-5) showed a correlation between laccase production and mycelial growth. For pH, a correlation was observed with laccase activity for T. polyzona U16-5 and between enzymatic production and mycelial biomass for U15-6. It is concluded that in the screening of strains with potential for use in industrial processes it is important to analyze potential inducers and different lighting combinations, as well as favorable cultivation conditions.
Keywords
Polyphenoloxidase. Mycelial biomass. Laccase inducers. White-rot fungi.