Pesquisa
Regeneração de dois tipos de explantes de milho submetidos à transformação por biobalística
Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura
Autor: Tiago Mateus Andrade Vidigal
Orientador: Nelson Barros Colauto
Defendido em: 17/05/2013
Resumo
Os métodos de transformação genética podem variar em eficiência e aplicabilidade de acordo com a espécie e tecido alvo. Em plantas monocotiledôneas como o milho, a biobalística tornou-se o método de escolha na maioria dos laboratórios. O emprego deste método requer a otimização de diversos parâmetros, entre eles, o desenvolvimento de protocolos para regeneração de plantas a partir de células. Há necessidade de se estabelecer protocolos adaptados para cada condição de laboratório, e avaliar sua eficiência. Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de regeneração de plantas de milho submetidas à transformação por biobalística a partir de calos embriogênicos do genótipo LD82025 e de explantes Split Seed do genótipo CP99566, utilizando o gene bar como marcador de seleção. Foram bombardeados 2000 clusters de calos embriogênicos de milho do genótipo LD82025 e 2000 explantes Split Seed do genótipo CP 99566. A seleção dos eventos de transformação foi realizada em meios de cultivo suplementados com glufosinato de amônio. As plântulas que passaram pelo processo de seleção foram transplantadas para vasos contendo terra e vermiculita. As plantas foram aclimatadas e posteriormente transplantadas para vasos em casa de vegetação. A análise dos eventos de transformação foi realizada por ensaio de tolerância ao herbicida glufosinato de amônia e reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção do gene marcador bar. Foi possível regenerar quatro plantas de milho do genótipo LD82025 por meio de embriogênese somática, correspondendo a uma frequência de regeneração 0,2%. Utilizando explantes Split Seed foram regeneradas 26 plantas, correspondendo a uma frequência de regeneração de 1,3%. As plantas regeneradas apresentaram sintomas ao glufosinato de amônio no ensaio de tolerância, porém não apresentaram o fragmento de 450 pb, compatível com o gene bar na análise de PCR. Embora ambos os protocolos possibilitem a regeneração de plantas de milho submetidas à transformação por biobalística, há a necessidade de adapta-los a fim de reduzir problemas como a contaminação por fungos e a possível formação de quimeras.
Palavras-chave
milho. embriogênese somática. Split Seeds. Biobalística. bar.
Title
Regeneration of two types of maize explants submitted to biolistics transformation
Abstract
The genetic transformation methods may vary in efficiency and applicability according to the species and target tissue. In monocotyledonous plants such as maize, the biolistic has become the method of choice in most laboratories. The employment of this method requires the optimization of several parameters, including the development of protocols for regeneration of plants from cells. It is necessary to establish protocols adapted to each laboratory condition, and evaluate its efficiency. The objectives of this study were to evaluate the efficiency of regeneration of maize plants submitted to biolistic transformation from embryogenic callus of the LD82025 genotype and split seed explants of the CP99566 genotype, using the gene bar as a selectable marker. It was bombarded 2000 clusters of embryogenic callus from LD82025 genotype and 2000 split seed explants from the CP 995666 genotype. It was performed the selection of transformation events in culture with supplemented glufosinate ammonium. Selected seedlings were transplanted to pots containing soil and vermiculite. The plants were acclimatized and subsequently transplanted to pots in the greenhouse.The analysis of the transformation events was performed by tolerance test to the herbicide glufosinate ammonium and polymerase chain reaction (PCR) for detection of the marker gene bar. It was possible to regenerate four maize plants from the LD82025 genotype by somatic embryogenesis, corresponding to a regeneration frequency of 0.2%. Using split seed explants 26 plants were regenerated, corresponding to a regeneration frequency of 1.3%. The regenerated plants showed symptoms to the glufosinato ammonium tolerance assay, but did not showed a fragment of 450 bp compatible with the gene bar in PCR analysis. Although both protocols allow the maize plant regeneration after transformation by biolistic, it is necessary to adapt the protocol in order to reduce problems such as fungal contamination and possible chimera formation.
Keywords
maize. Somatic. Embryogenesis. Split Seeds. Biolistics. bar.